中國藥典-藥品微生物檢查

1、2021/2/71藥品微生物檢查2021/2/72 本課件是結(jié)合本課件是結(jié)合中國藥典中國藥典 2010年版年版與與2015年版通則微生物內(nèi)容第三次公示稿年版通則微生物內(nèi)容第三次公示稿(2014-09-28發(fā)布)進(jìn)行講解。進(jìn)行講解。2021/2/73網(wǎng)址網(wǎng)址:2021/2/7420152015年版微生物學(xué)檢驗中的重大修訂及意義年版微生物學(xué)檢驗中的重大修訂及意義1 1、實驗環(huán)境的重大修訂、實驗環(huán)境的重大修訂無菌檢查環(huán)境潔凈度規(guī)定微生物限度檢查環(huán)境潔凈度規(guī)定2 2、培養(yǎng)系統(tǒng)的重大修訂、培養(yǎng)系統(tǒng)的重大修訂無菌檢查中培養(yǎng)基的修訂微生物計數(shù)法中培養(yǎng)基的修訂控制菌檢查法中控制菌的修訂抑菌效力測定法中培養(yǎng)基的

2、修訂3 3、對一、二、三部微生物學(xué)附錄的整合、修訂、對一、二、三部微生物學(xué)附錄的整合、修訂2021/2/7520152015年版微生物學(xué)檢驗中的重大修訂及意義年版微生物學(xué)檢驗中的重大修訂及意義 與USP35版、EP7.0版、JP16版比較,2015年版中國藥典微生物學(xué)檢驗體系規(guī)劃收載的項目和內(nèi)容已基本趨向一致,將使我國藥典的微生物學(xué)檢驗成為一個比較完備的標(biāo)準(zhǔn)體系,其意義在于:1、全面與國際藥典標(biāo)準(zhǔn)接軌;2、從對終產(chǎn)品的檢驗向過程控制轉(zhuǎn)變。 2021/2/76藥品微生物檢查藥品微生物檢查1、無菌檢查法2、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:

3、控制菌檢查法 非無菌藥品的微生物限度2021/2/77一、無菌檢查法一、無菌檢查法1. 總則總則:環(huán)境、設(shè)備、人員2. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基:品種、制備、滅菌、貯存、適用性檢查3. 稀釋液、沖洗液稀釋液、沖洗液:品種、制備、滅菌4. 方法適用性試驗方法適用性試驗:直接接種法、薄膜過濾法5. 供試品的無菌檢查供試品的無菌檢查:供試品的處理、對照試驗、直接接種法、薄膜過濾法、培養(yǎng)及觀察6. 結(jié)果判斷結(jié)果判斷2021/2/781.總則總則 1）對象）對象: 無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定法的

4、規(guī)定,僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。現(xiàn)微生物污染。一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/791.總則總則 2）環(huán)境）環(huán)境: 應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行,試驗環(huán)境必須達(dá)到無菌檢查的要求,（ 9203 藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則:環(huán)境潔凈度B 級背景下的局部A 級潔凈度的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行） 【 10版:應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行】,其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。 A 級和 B 級區(qū)域的空氣供給應(yīng)通過終端高效空氣過濾器（HE

5、PA） 。 一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/7101.總則總則 2）環(huán)境）環(huán)境: 單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法（GB/T16292、16293、16294-2010 ）現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度確認(rèn)。 隔離系統(tǒng)應(yīng)定期按相關(guān)的要求（【15版9206 無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則 】）進(jìn)行驗證,其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/7111.總則總則 3）人員）人員: 【10版:無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識,并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)?！?15版刪除。一一、

6、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/7122.培養(yǎng)基培養(yǎng)基一一、無菌檢查法無菌檢查法內(nèi)內(nèi)容容2010版版2015版版培養(yǎng)系統(tǒng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中和或滅活用培養(yǎng)基 0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基2021/2/7132.培養(yǎng)基培養(yǎng)基 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng),也可用于需氣菌培養(yǎng)。 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基適用于真菌和需氣菌的培養(yǎng)。 1）培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件）

7、培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件 配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌 制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225、避光的環(huán)境 若保存于非密閉容器中,一般在3周內(nèi)使用;若保存于密閉容器中,一般可在一年內(nèi)使用。 一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/7142.培養(yǎng)基培養(yǎng)基2）培養(yǎng)基適用性檢查）培養(yǎng)基適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。 一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/7152.培養(yǎng)基培養(yǎng)基2）培養(yǎng)基適用性檢查）培養(yǎng)基適用性檢查 無菌性檢查無菌性檢查:每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于 5 支（

8、瓶） ,置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng) 14天,應(yīng)無菌生長。 靈敏度檢查靈敏度檢查 菌種菌種 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過不得超過5 代代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代）,并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存,以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。菌液:濃度100cfu/ml接種:2管+菌液,1管空白結(jié)果判斷:+菌液-生長良好 空白-無菌生長一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/716 培養(yǎng)基靈敏度檢查培養(yǎng)基靈敏度檢查金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨液體（瓊脂）培養(yǎng)基【10版:營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 】3035 18h24h 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌生孢梭

9、菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 白色念珠菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液體（瓊脂）培養(yǎng)基 【10版:改良馬?。ō傊┡囵B(yǎng)基 】2025【10版:23-28 】24h48h黑曲霉黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基或用適宜方法制成孢子懸液 【10版:改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基 】5d7d菌液制備菌液制備: 取菌種新鮮培養(yǎng)物接種至相應(yīng)培養(yǎng)基,培養(yǎng)。上述培養(yǎng)物用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液。 一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/717 培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基接種:取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支,每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7

10、支,分別接種相應(yīng)菌液。逐日觀察結(jié)果。 一一、無菌檢查法無菌檢查法金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌各2支硫乙醇酸鹽硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基流體培養(yǎng)基3035 3d銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌生孢梭菌生孢梭菌空白空白1支枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌各2支胰酪大豆胨胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基【10版:改良馬丁培養(yǎng)基】2025 5d白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉空白空白1支 結(jié)果判定結(jié)果判定:空白對照管應(yīng)無菌生長,若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好,判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。 培養(yǎng)基靈敏度檢查培養(yǎng)基靈敏度檢查2021/2/7184.方法適用性試驗方法適用性試驗（方法驗證試驗）（方法驗證試驗）當(dāng)進(jìn)行產(chǎn)品無菌檢查法時

11、,應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗,以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時,應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗。 驗證時,按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對每一試驗菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗證。方法適用性試驗也可與供試品的無菌檢查同時進(jìn)方法適用性試驗也可與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行行 。一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/7195.供試品的無菌檢查供試品的無菌檢查無菌檢查法包括 薄膜過濾法 直接接種法只要供試品性質(zhì)允許,應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與方法適用性試驗確認(rèn)的方法相同。方法適用性

12、試驗確認(rèn)的方法相同。無菌試驗過程中無菌試驗過程中,若需使用表面活性劑、滅活劑、中若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑和劑等試劑,應(yīng)證明其有效性應(yīng)證明其有效性,且對微生物無毒性。且對微生物無毒性。一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/720 陽性對照陽性對照 應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌: 無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品,以金黃色葡萄球菌為對照菌; 抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌; 抗厭氧菌的供試品,以生孢梭菌為對照菌; 抗真菌的供試品,以白色念珠菌為對照菌。 陽性對照試驗的菌液制備同方法適用性試驗,加菌量小于100CFU,供試品用量同供試品無菌檢查時每份培養(yǎng)基接種的

13、樣品量。 陽性對照管培養(yǎng)4872 小時應(yīng)生長良好。 陰性對照陰性對照 供試品無菌檢查時,應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。 一一、無菌檢查法無菌檢查法5.供試品的無菌檢查供試品的無菌檢查2021/2/7211. 薄膜過濾法薄膜過濾法 薄膜過濾法應(yīng)采用封閉式薄膜過濾器?！?0版刪除:可用一般薄膜過濾器】。無菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45m。直徑約為50mm。 根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)?！?0版刪除:抗生素供試品應(yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜。 濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。 】使用時,應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。一一、無菌檢查法無菌檢查

14、法5.供試品的無菌檢查供試品的無菌檢查2021/2/7221. 薄膜過濾法薄膜過濾法 水溶性供試液過濾前應(yīng)先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。 供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為每張濾膜每次沖洗量一般為100ml,且總沖洗量且總沖洗量不得超過不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損以避免濾膜上的微生物受損傷。傷。 略:不同供試品的過濾方法。增加:具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品一項一一、無菌檢查法無菌檢查法5.供試品的無菌檢查供試品

15、的無菌檢查2021/2/723 2. 直接接種法直接接種法 直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查的供試品,即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。 除生物制品外,一般樣品無菌檢查時兩種培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)相等;生物制品無菌檢查時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)為2:1。 除另有規(guī)定外,每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%,同時,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml,胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢查時,培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗。 一一、無菌檢查法無菌檢查法5

16、.供試品的無菌檢查供試品的無菌檢查2021/2/724 培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)及觀察 將上述接種供試品后的培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天;接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應(yīng)分成兩等份,一份置3035培養(yǎng),一份置2025培養(yǎng)。 培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁,培養(yǎng)14 天后,不能從外觀上判斷有無微生物生長,可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3 天,觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁;或取培養(yǎng)液涂片,染色,鏡檢,判斷是否有菌。 一一、無菌檢查法無菌檢查法5.供試品的無菌檢查供試品的無菌檢查2021/2/725

17、結(jié)果判斷結(jié)果判斷 陽性對照管應(yīng)生長良好,陰性對照管不得有菌生長。否則,試驗無效。 若供試品管均澄清,或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長,判供試品符合規(guī)定;若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長,判供試品不符合規(guī)定,除非能充分證明試驗結(jié)果無效,即生長的微生物非供試品所含。一一、無菌檢查法無菌檢查法5.供試品的無菌檢查供試品的無菌檢查2021/2/726 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 當(dāng)符合下列至少一個條件時方可判試驗結(jié)果無效: （1）無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。 （2）回顧無菌試驗過程,發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。 （3）供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后,確證是因無菌試驗

18、中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。 試驗若經(jīng)確認(rèn)無效,應(yīng)重試。重試時,重新取同量供試品,依法檢查,若無菌生長,判供試品符合規(guī)定;若有菌生長,判供試品不符合規(guī)定。 一一、無菌檢查法無菌檢查法5.供試品的無菌檢查供試品的無菌檢查2021/2/727一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/728一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/729一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/730一一、無菌檢查法無菌檢查法2021/2/731微生物限度檢查法微生物限度檢查法中國藥典中國藥典2015年版修訂后將分為三個附錄年版修訂后將分為三個附錄: 1、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法 2、非無

19、菌產(chǎn)品微生物限度檢查:控制菌檢查法 3、非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn) 二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7321.1 總則總則:環(huán)境、要求1.2 計數(shù)方法計數(shù)方法:平皿法、薄膜過濾法、最可能數(shù)法（MPN法）1.3 計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計數(shù)方法適用供試品計數(shù)方法適用性試驗性試驗:菌種及菌液制備、培養(yǎng)基適用性檢查、計數(shù)方法適用性試驗、1.4 供試品檢查供試品檢查:檢驗量、供試品檢查1.5 結(jié)果判斷結(jié)果判斷1.6 稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.非無菌產(chǎn)品微生物限度檢

20、查非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:-微生物計數(shù)法微生物計數(shù)法2021/2/733 微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計數(shù)。 當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時,應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行檢驗,包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外,本法不適用于活菌制劑的檢查。 本檢查法可采用替代的微生物檢查法,包括自動檢測方法,但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.1 總則總則:2021/2/7341.1 總則總則:環(huán)境環(huán)境: 微生物計數(shù)試驗環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。(在不低于GMP 現(xiàn)行版要求的D

21、 級潔凈環(huán)境、局部潔凈度不低于B 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行)【10版:在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)】。 檢驗全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。 單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7351.1 總則總則: 如供試品有抗菌活性,應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和劑或滅活劑,應(yīng)確認(rèn)其有效性及對微生物無毒性。 供試液制備時如果使用了表面活性劑,應(yīng)確認(rèn)其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。二、非無菌產(chǎn)品微生物限

22、度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/736 平皿法平皿法 薄膜過濾法薄膜過濾法 最可能數(shù)法最可能數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod,簡稱MPN 法）。 MPN 法用于微生物計數(shù)時精確度較差,但對于某些微生物污染量很小的供試品,MPN 法可能是更適合的方法。供試品檢查時, 應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計數(shù)方法,所選的方法必須具備檢測充足樣品量的能力,以保證所獲得的試驗結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.2計數(shù)方法計數(shù)方法:2021/2/737 供試品微生物計數(shù)中

23、所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。 供試品的微生物計數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗【10版:方法驗證】, 以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)。 若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時, 計數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗。 二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.3 計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計供試品計 數(shù)方法適用性試驗數(shù)方法適用性試驗2021/2/738 1.3.1菌液制備及使用 1.3.2計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查 1.3.3計數(shù)方法適用性試驗二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.3 計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供

24、試品計供試品計 數(shù)方法適用性試驗數(shù)方法適用性試驗2021/2/739 1.3.1菌液制備及使用 菌種菌種 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代）,并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存,以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.3 計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計供試品計 數(shù)方法適用性試驗數(shù)方法適用性試驗2021/2/740菌液制備后若在室溫下放置,應(yīng)在2 小時內(nèi)使用;若保存在28,可在24小時內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在28,在驗證過的貯存期內(nèi)使用。 1.3.1菌液制備及使用菌液制備及使

25、用二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查試驗菌株試驗菌株試驗菌液的制備試驗菌液的制備金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26 003)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基【10版:營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基】3035,1824小時銅綠假單胞菌CMCC（B)10 104枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63 501白色念珠菌CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基,2025,23 天 【10版:改良馬?。ō傊┡囵B(yǎng)基,2328 ,2448h】黑曲霉CMCC(F) 98 003沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 ,2025,57天 ,或直接獲得豐富

26、孢子【10版:改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基,2328 ,57天】2021/2/7411.3.2計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查【10版版】二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查細(xì)菌計數(shù)金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3035 不超過3天銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌霉菌及酵母菌計數(shù)白色念珠菌玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基2025 不超過5天黑曲霉每一試驗菌株平行制備2 管或2 個平皿;接種量接種量50100cfu ;同時,用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。結(jié)果判定結(jié)果判定:若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70 %,且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致,判該

27、培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。 2021/2/7421.3.2計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查【15版版】二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查需氧菌總數(shù)需氧菌總數(shù)計數(shù)計數(shù)金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基3035 不超過3天銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌白色念珠菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基3035 不超過不超過5天天黑曲霉黑曲霉霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基2025 不超過5天黑曲霉每一試驗菌株平行制備2 管或2 個平皿;接種量不大于100cfu ;同時,用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。結(jié)果判定

28、結(jié)果判定:被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2 范圍內(nèi),且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致;被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較,試驗菌應(yīng)生長良好。2021/2/743二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.3.3計數(shù)方法適用性試驗計數(shù)方法適用性試驗 供試液制備 接種和稀釋 抗菌活性的去除與滅活 供試品中微生物的回收平皿法薄膜過濾法最可能數(shù)法（MPN 法） 結(jié)果判斷2021/2/744 1.4.1檢驗量檢驗量 檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm ）。 除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗量為10g 或10ml;膜劑為100c

29、m ;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時,應(yīng)從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品,大蜜丸還不得少于4 丸,膜劑還不得少于4 片。 一般應(yīng)隨機(jī)抽取供試品,取規(guī)定容器數(shù),混合,取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4 供試品檢查供試品檢查2021/2/745 按計數(shù)方法適用性試驗確認(rèn)的計數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù); 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。 陰性對照試驗陰性對照試驗 以稀釋劑代替供試液進(jìn)行陰性對照試驗,陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如果

30、陰性對照有菌生長,應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試品檢查2021/2/746 供試液制備供試液制備 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時,應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過 45。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基,不得超過 1小時。 常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用,應(yīng)建立其他適宜的方法。 二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試品檢查2021/2/747 供試液制備供試液制備 水溶性供試品水溶性供試品 取供試品,用 pH7.0

31、 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,或pH7.2 磷酸鹽緩沖液,或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成 1:10 供試液。若需要,調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 68。必要時,用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。 二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試品檢查2021/2/748二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試品檢查 供試液制備供試液制備 水不溶性非油脂類供試品水不溶性非油脂類供試品 取供試品, 用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液,或

32、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成 1:10 供試液。分散力較差的供試品,可在稀釋液中加入表面活性劑如 0.1%的聚山梨酯 80,使供試品分散均勻。若需要,調(diào)節(jié)供試液 pH值至 68。必要時,用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10倍系列稀釋。 2021/2/749二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試品檢查 供試液制備供試液制備 油脂類供試品油脂類供試品 取供試品,加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解,或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯 80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過 40（特殊情況下,最多不超過 45）,小心混合,若需要可在水

33、浴中進(jìn)行,然后加入預(yù)熱的稀釋液使成 1 10供試液,保溫,混合,并在最短時間內(nèi)形成乳狀液。必要時,用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步 10倍系列稀釋。 2021/2/750二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試品檢查 供試液制備供試液制備 需用特殊方法制備供試液的供試品需用特殊方法制備供試液的供試品 膜劑供試品 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 氣霧劑、噴霧劑供試品 貼膏劑供試品2021/2/751 平皿法平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。 除另有規(guī)定外,取規(guī)定量供試品,按方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測定,每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿

34、。 培養(yǎng)和計數(shù) 除另有規(guī)定外,胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在3035培養(yǎng)3天,沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在2025培養(yǎng)5 天, 觀察菌落生長情況,點計平板上生長的所有菌落數(shù),必要時可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至7 天進(jìn)行菌落計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平皿不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后,計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù),按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。 若同稀釋級兩個平皿的菌落數(shù)平均值不小于15,則兩個平皿的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試品檢查2021/2/752菌數(shù)報告規(guī)則菌數(shù)報告規(guī)則 需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu 的稀釋級、

35、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu 的稀釋級,作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù),計算1g、1ml 或10 cm 供試品中所含的微生物數(shù)。 如各稀釋級的平皿均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落數(shù)小于1 時,以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。 二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/753 薄膜過濾法薄膜過濾法 除另有規(guī)定外,按計數(shù)方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于1g、1ml 或10 cm 供試品的供試液,若供試品所含的菌數(shù)較多時,可取適宜稀釋級的供試液,照方法適用性試驗確認(rèn)的方法加至適量

36、稀釋液中,立即過濾,沖洗,沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 培養(yǎng)和計數(shù) 培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿計數(shù)法,每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/754 菌數(shù)報告規(guī)則菌數(shù)報告規(guī)則 以相當(dāng)于 1g、1ml 或10cm2 供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù);若濾膜上無菌落生長,以1 報告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml 或10cm2 供試品）,或1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/755 MPN 法法 取規(guī)定量供試品,按方法適用性試

37、驗確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種,所有試驗管在3035培養(yǎng)35 天,如果需要確認(rèn)是否有微生物生長,按方法適應(yīng)性試驗確定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級微生物生長的管數(shù),從表3查對每1g 或1ml 供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7561.5結(jié)果判斷結(jié)果判斷 需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）; 霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。 若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求,可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏

38、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。 使用選擇性培養(yǎng)基時,應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用MPN 法,測定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/757 各品種項下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下: 101cfu: 可接受的最大菌數(shù)為20; 102cfu: 可接受的最大菌數(shù)為200; 103cfu: 可接受的最大菌數(shù)為2000:依此類推。 若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)定,判供試品符合規(guī)定;若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定,判供試品不符合規(guī)定。二、非無菌產(chǎn)品微生物

39、限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.5結(jié)果判斷結(jié)果判斷2021/2/7582.1 總則總則:環(huán)境、要求2.2 培養(yǎng)基適用性檢查和培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試控制菌檢查方法適用性試驗驗:菌種及菌液制備、培養(yǎng)基適用性檢查、控制菌檢查方法適用性試驗、2.3 供試品檢查供試品檢查:陰性對照試驗、陽性對照試驗、耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌2.4 稀釋液稀釋液二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:-控制菌檢查法控制菌檢查法2021/2/7592.1總則總則 控制菌

40、檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下,檢查供試品中是否存在特定的微生物。 當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時,應(yīng)按下列規(guī)定進(jìn)行檢驗,包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。 本檢查法可采用替代的微生物檢查法,包括自動檢測方法,但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。 供試液制備及實驗環(huán)境要求同“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法”（通則1105）。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/760 如果供試品具有抗菌活性,應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和劑或滅活劑,應(yīng)確認(rèn)有效性及對微生物無毒性。 供試液制備時如果使用了表面活性劑,

41、應(yīng)確認(rèn)其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7612.2 培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗方法適用性試驗 2.2.1菌液制備 2.2.2培養(yǎng)基的適用性檢查 2.2.2 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查 2.2.3控制菌檢查方法適用性試驗二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/762菌液制備后若在室溫下放置,應(yīng)在2 小時內(nèi)使用;若保存在28,可在24小時內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液,穩(wěn)定的孢子懸液可保存在28,在驗證過的貯存期內(nèi)使用。

42、 2.2.1菌液制備菌液制備二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查試驗菌株試驗菌株試驗菌液的制備試驗菌液的制備金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基3035,1824小時銅綠假單胞菌CMCC（B)10 104大腸埃希菌CMCC（B）44 102 乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）50 094 白色念珠菌CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基,2025,23 天 生孢梭菌CMCC（B）64 941 梭菌增菌培養(yǎng)基,厭氧條件下3035,2448 小時或接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中3035,1824 小時 2

43、021/2/7632.2.2 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查,檢查項目包括 促生長能力促生長能力 抑制能力抑制能力 指示能力指示能力 各培養(yǎng)基的檢測項目及所用菌株見表1。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7642.2.2 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查控制菌檢查培養(yǎng)基培養(yǎng)基特性特性試驗菌株試驗菌株耐膽鹽革蘭耐膽鹽革蘭氏陰性菌氏陰性菌【15版版:新新增增】腸道菌增菌液體培養(yǎng)基腸道菌增菌液體培養(yǎng)基促生長能力促生長能力大腸埃希菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌抑

44、制能力抑制能力金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基養(yǎng)基促生長能力促生長能力+指示特性指示特性大腸埃希菌大腸埃希菌大腸埃希菌大腸埃希菌麥康凱液體培養(yǎng)基麥康凱液體培養(yǎng)基促生長能力促生長能力大腸埃希菌大腸埃希菌抑制能力抑制能力金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力促生長能力+指示特性指示特性大腸埃希菌大腸埃希菌【10版版:大大腸菌群腸菌群】乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基促生長能力促生長能力大腸埃希菌大腸埃希菌抑制能力抑制能力金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 促生長能力促生長能力+指示能力指示能力 大腸埃

45、希菌大腸埃希菌 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 促生長能力促生長能力+指示能力指示能力 大腸埃希菌大腸埃希菌 表表1控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示特性控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示特性二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/765 液體培養(yǎng)基促生長能力檢查液體培養(yǎng)基促生長能力檢查 分別接種不大于100cfu 的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中,在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng),與對照培養(yǎng)基管比較,被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好。 固體培養(yǎng)基促生長能力檢查固體培

46、養(yǎng)基促生長能力檢查 用涂布法分別接種不大于100cfu 【10版:50100cfu】的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上,在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng),被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/766 培養(yǎng)基抑制能力檢查培養(yǎng)基抑制能力檢查 接種不少于不少于100cfu 的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中,在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不短于規(guī)定的最長培養(yǎng)時間下培養(yǎng),試驗菌應(yīng)不得生長。 培養(yǎng)基指示特性檢查培養(yǎng)基指示特性檢查 用涂布法分別接種不大于不大于100cfu 的試驗菌于

47、被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上,在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng),被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7672.2.3控制菌檢查方法適用性試驗控制菌檢查方法適用性試驗 試驗菌試驗菌 根據(jù)各品種項下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗菌株,確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時,采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。結(jié)果判斷結(jié)果判斷 上述試驗若檢出試驗菌,按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查;若未檢出試驗菌,應(yīng)消除供試品的抑菌活性,并重新進(jìn)行方法

48、適用性試驗。 如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除,可認(rèn)為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中,選擇抑菌成份消除相對徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。 二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7682.3供試品檢查供試品檢查 供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行。 供試品檢出控制菌或其他致病菌時供試品檢出控制菌或其他致病菌時,按一次檢出按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)結(jié)果為準(zhǔn),不再復(fù)試。不再復(fù)試。 陽性對照試驗陽性對照試驗 陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查,對照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對照試驗陰性對照試驗 以

49、稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查,陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如果陰性對照有菌生長,應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/769 控制菌檢查過程: 使用無選擇性增菌培養(yǎng)基（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）培養(yǎng),使受損的細(xì)菌得到修復(fù),提高檢出率。 增菌培養(yǎng)-選擇性增菌-選擇性瓊脂二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3供試品檢查供試品檢查2021/2/770 2.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌【10版:大腸菌群】 2.3.2大腸埃希菌 2.3.3沙門菌 2.3.4銅綠假單胞菌 2.3.5金黃色葡萄球菌 2.3.6梭菌 2.3.7白色念珠菌二、

50、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3供試品檢查供試品檢查2021/2/7712.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌耐膽鹽革蘭陰性菌【15版新增版新增】 供試液制備和供試液制備和預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng) 取供試品,用胰酪大豆胨液體作為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法” （通則1105）制成1:10 供試液,混勻,在2025培養(yǎng),培養(yǎng)時間應(yīng)使供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不增殖（約2 小時）。 定性試驗定性試驗 除另有規(guī)定外,取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中,3035培養(yǎng)2448 小時后,劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上,3035培養(yǎng)1824

51、 小時。如果平板上無菌落生長,判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7722.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌耐膽鹽革蘭陰性菌【15版新版新增增】 定量試驗定量試驗 選擇和分離培養(yǎng) 取相當(dāng)于0.1g、0.01g 和0.001g（或0.1mL、0.01mL 和0.001mL）供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中,3035培養(yǎng)2448 小時。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上,3035培養(yǎng)1824 小時。 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長,則對應(yīng)培養(yǎng)管為陽性,否則為陰性。

52、根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果,從表2 查對1g 或1ml 供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的最大可能數(shù)。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/773 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品lg、lml、10cm),直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1824小時,必要時可延長至48小時。 取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi),培養(yǎng),于5小時、24小時在366nm紫外光下觀察,同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光,為MUG陽性;不呈現(xiàn)熒光,為MUG陰性。觀察后,沿培養(yǎng)管的管壁加人數(shù)滴靛基質(zhì)試液,液面呈玫瑰紅色

53、,為靛基質(zhì)陽性;呈試劑本色,為靛基質(zhì)陰性。本底對照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3.1大腸菌群大腸菌群【10版版】2021/2/774如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性,判供試品檢出大腸埃希菌;如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌;如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性,或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性,則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)1824小時。 若平板上無菌落生長或生長的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,應(yīng)進(jìn)行分

54、離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗,確認(rèn)是否為大腸埃希菌。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3.1大腸菌群大腸菌群【10版版】2021/2/7752.3.2大腸埃希菌大腸埃希菌 供試液制備和供試液制備和增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng) 取供試品,照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法” （通則1105）制成1:10 供試液。取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的供試液,接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,3035培養(yǎng)1824 小時。 選擇和分離培養(yǎng)選擇和分離培養(yǎng) 取上述預(yù)培養(yǎng)物1mL 接種至100mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中,4244培養(yǎng)2448 小時。

55、取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,3035培養(yǎng)1872 小時。 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長,應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗, 確證是否為大腸埃希菌;若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長,或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7762.3.3沙門菌沙門菌含藥材原粉化學(xué)藥和中藥制劑及臟器提取物的口服制劑【10版:含動物組織及動物類原藥材粉的口服制劑】每10g或10ml不得檢出沙門菌供試液制備和供試液制備和增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng) 取10g 或10mL 供試品直接或處理后接

56、種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,3035培養(yǎng)1824 小時。選擇和分離培養(yǎng)選擇和分離培養(yǎng) 取上述預(yù)培養(yǎng)物0.1mL 接種至10mL RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基中,3035培養(yǎng)1824 小時。取少量RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上,3035培養(yǎng)1848 小時。 沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好,菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種,培養(yǎng)1824 小時,或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌

57、產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7772.3.3沙門菌沙門菌 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長,且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色,或斜面黃色、底層黃色或黑色,應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗, 確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長,或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性,或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色;或斜面黃色、底層未見黃色黑色,判供試品未檢出沙門菌。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/7782.3.4銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 供試液制備和增菌培養(yǎng)供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品,照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢

58、查:微生物計數(shù)法” （通則1105）制成1:10 供試液。取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的供試液,接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻。3035培養(yǎng)1824 小時。 選擇和分離培養(yǎng)選擇和分離培養(yǎng) 取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上,3035培養(yǎng)1872 小時。 取上述平板上生長的菌落進(jìn)行氧化酶試驗,或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。 氧化酶試驗氧化酶試驗 將潔凈濾紙片置于平皿內(nèi),用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上,滴加新配制的1二鹽酸二甲基對苯二胺試液,在30 秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性,否則為陰性。二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查二、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查2021/2/