DNA提取及PCR擴增試驗報告

1、PCR擴增及DNA瓊脂糖凝膠電泳劉琳1131428環(huán)境科學一、實驗目的1 學習并掌握PCR擴增的基本原理與實驗技術。2 對擴增后的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳試驗，并分析相應結果。二、實驗原理1. PCR擴增多聚酶鏈反應（PCR ）技術的原理類似于 DNA的天然復制過程。 在微量離心管中加入 適量緩沖液，加入微量模板DNA、四種脫氧核苷酸（dNTP ）、耐熱Taq聚合酶及兩個合成DNA的引物，而后加熱使模板DNA在高溫下（94 C）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶液溫度，使合成引物在低溫（55 C）與模板DNA互補退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。溶液反應溫度升至中溫（72 C）,在Ta

2、p酶作用下，用四種 dNTP為原料，引物為復制起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復，在同一反應體系中可重復高溫變性、低溫退火和DNA合成這一循環(huán)，使產物DNA重復合成，并在重復過程中，前一循環(huán)的產物DNA可作為后一循環(huán)的模板 DNA而參與DNA的合成，使產物 DNA的量按指數(shù)方式擴增。經(jīng)過3040個循環(huán)，DNA擴增即可完成。2. DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度 下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比

3、。不同構型的DNA分子的遷移速度不同。 該電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。三、實驗材料儀器：PCR擴增儀、0.2ul薄壁管、1.5ml離心管、移液槍、槍頭、微波爐、電泳儀、 水平電泳槽、制膠版、紫外透射儀。試劑：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、兩種引物、16S全長DNA樣本、無菌ddH?。、 模板DNA、TBE、瓊脂糖、EB、顯色劑。四、實驗步驟1. PCR擴增本次試驗選擇細菌 16S rDNA V3區(qū)片段進行擴增。1.1 根據(jù)計算，首先取 1.5ml 離心管按照 2.5ul 10 x Buffer、1 ul dNT

4、P、0.5 ul 341GC、 0.5 ul 534、0.125 ul Taq、19.375u ddH 2O的比例配置足量的 PCR反應體系。1.2分別向9個薄壁管中分別加入 24 ul的反應體系，并分別添加8種不同的模版，并于第9個薄壁管中加入無菌 ddH 20作為陰性對照。1.3將薄壁管放入 PCR擴增儀中，按照預定程序進行PCR擴增。其中循環(huán)過程需要達到3040次。程序如下：預變性：94 C3min循環(huán)：94 C變性30s55 C退火30s72 C延伸30s末次延伸：72 C5min1.4 PCR擴增完成后，將樣品取出并保存于 15 C環(huán)境中。2. DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗2.1稱取0.

5、2g瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的0.5 XTBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。搖勻，待冷卻至60 C左右，在膠液內加入適量的 EB。2.2取有機玻璃制膠板槽，在一端插好梳子，在槽內緩慢倒入已冷至60 C左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。2.3待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。2.4在槽內加入0.5 XTBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。取1卩1緩沖液和5卩1待測DNA樣品混合后，用移液槍滴加至凝膠的加樣孔中。2.5接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調節(jié)穩(wěn)壓輸出，電壓最高不超過5V/cm，開始電泳。點樣端放陰極端。根據(jù)經(jīng)驗調節(jié)電壓使分帶清晰。

6、2.6觀察溴酚蘭的帶（藍色）的移動。當其移動至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳。2.7在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。 關上樣品室外門，打開紫外燈，通過觀察孔進行觀察。五、實驗結果與討論如圖所示：從左至右，分別是模版1-8號，第9列為陰性對照。前8列均有明顯的條帶出現(xiàn)，而陰性對照無顯示，說明擴增整體效果很 好。圖中有上下兩條線，上面一條線所 覆蓋的條帶基本可以代表擴增的產生 的片段位置，參照圖可以看出擴增片段 在200bp左右。在第9個陰性對照的第 二條線處可以看到較為模糊的條帶，并 非是出現(xiàn)假陰性，而是由于二聚物而產 生的條帶。通過該條帶與最右側的

7、 marker對比可知該片段出現(xiàn)在 100bp左 右，并非由于實驗操作等問題而產生的 污染。實驗的照片顯示實驗結果有拖尾 現(xiàn)象，但是并不影響后續(xù)實驗。在實驗 過程中由于有些試劑加到了管壁上面， 并沒有完全加入，可能會出現(xiàn)一些誤 差。另外在第1列條帶中出現(xiàn)了其他的亮帶，可能是由于在前期的擴增實驗中滴加試劑時由于量過少而進行的搖勻和融合等操作產生了非特異性擴增，也有可能是因為膠板制作過程中梳子的位置不合適或者膠板制作時邊緣處不夠均勻導致產生污染。但總體而言，實驗結果 較為滿意。六、實驗注意事項1. 由于PCR技術非常敏感，可使一個 DNA分子得以擴增，裝有 PCR試劑的離心管打開之前，應先在微量離

8、心機上作瞬間離心使液體沉積于管底。PCR擴增反應的條件，要控制好溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。2. 最好在加完所有其它反應成分后才加模板DNA。3. 配瓊脂糖時應使其完全溶化后方可制膠。4. EB具有致癌作用，配制及使用時應帶一次性手套。并在專門的實驗室內使用。七、實驗收獲1. 通過本次實驗學習并掌握了PCR反應的基本原理、實驗過程及技術。2. 通過本次實驗掌握了電泳實驗分離DNA的原理和方法。八、思考題1、如果你的研究中要擴增大腸桿菌某個酶的基因，你如何進行相關實驗？通過PCR擴增出想要的片段，然后通過凝膠電泳實驗進行回收，并與合適的載體連接，轉化進感受態(tài)細胞。經(jīng)過培養(yǎng)提取質粒，進行酶切或PCR驗證

9、，測序最終驗證，保存菌種2對引物序列為 5 -GACTCCAGTCGAATCTACCA- 3和5 -AACCGTGGCGACACCGCTAA 請計算它們的Tm值及選擇合適的退火溫度，如果按你 算的退火溫度做PCR時沒有得到相應的產物，你怎么解決？5 -GACTCCAGTCGAATCTACCA- 3Tm 值=4 (G+C ) +2(A+T)-(5 10 C ) =4 ( 3+7 ) +2 (6+4 ) -(5 10 C ) =60 C -(5 10 C ) =5055 C5-AACCGTGGCGACACCGCTAATm 值=4 (G+C ) +2(A+T) -(5 10 C )=4(5+7)+2(6+2) -(510 C )=64 C -(5 10 C )=5459 C因此退火溫度可以選擇在 55 C可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5 C,以2C為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形 成。為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異