第五部分動植物細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)教學(xué)課件

1、第五章第五章動植物細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)動植物細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)5.15.1、動植物細(xì)胞培養(yǎng)動植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性的特性5.25.2、植物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動力學(xué)、植物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動力學(xué)5.35.3、動、動物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動力學(xué)物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動力學(xué)本本 章章 主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容5.1 動植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：是一項(xiàng)將動植物組織、器官或細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行無菌繁殖的技術(shù)。5.1.1 動物細(xì)胞培養(yǎng)的特性 由于動物細(xì)胞體外培養(yǎng)具有明顯的表達(dá)產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所無法取代，因此，生物技術(shù)中許多有價(jià)值的生物制品，需要借助于動物細(xì)胞培養(yǎng)而獲得，這種需求極大地促進(jìn)了動物

2、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。 早在1907年，美國的harrison在世界上首次將蛙的神經(jīng)組織在試管內(nèi)培養(yǎng)成功，建立起動物組織體外培養(yǎng)的第一塊基石。 1950年前后，enders及其同事發(fā)表了第一篇關(guān)于在培養(yǎng)細(xì)胞中生長病毒的報(bào)告，開拓了以動物病毒為研究對象的新領(lǐng)域。 作為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，copsik等人成功的進(jìn)行了有關(guān)倉鼠腎細(xì)胞（bhk）的懸浮培養(yǎng)。隨后，采用在培養(yǎng)液中添加人工合成的小球狀惰性聚合體載體，大幅度提高了細(xì)胞的產(chǎn)量，并在10000升發(fā)酵罐內(nèi)成功地進(jìn)行深層培養(yǎng)。 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到有許多基因產(chǎn)物不能在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，它們需要經(jīng)過真核細(xì)胞所特有的翻譯后修飾，以及正確的切割、

3、折疊后，才能形成與自然分子一樣的功能和抗原性。使得動物細(xì)胞一躍成為一種重要的宿主細(xì)胞，用以生成多種生物制品，例如病毒疫苗、淋巴因子（干抗素和白細(xì)胞介素等）、單克隆體、紅細(xì)胞生成素、纖維蛋白溶酶原激活劑、第八因子、腫瘤壞死因子、上皮生長因子和過氧化物歧化酶等。這些采用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)貴重藥品在臨床診斷、治療和預(yù)防等方面都有重要意義。動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；生長速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素；大多數(shù)哺乳動物需附著在固體或半固體的表面生長；對營養(yǎng)要求嚴(yán)格；大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可簡單地套用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。動物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的不同點(diǎn)動物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的不

4、同點(diǎn)動植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)性能的相比動植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)性能的相比項(xiàng)目項(xiàng)目哺乳動物細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞植物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞大小m懸浮生長營養(yǎng)要求倍增時(shí)間h 細(xì)胞分化環(huán)境的敏感性細(xì)胞壁產(chǎn)物存在產(chǎn)物濃度（%）含水量產(chǎn)物種類10100可以，多采用貼壁很復(fù)雜15100有非常敏感無125胞內(nèi)或胞外低疫苗、激素、抗體、生長因子、免疫調(diào)節(jié)劑等10100可以，但細(xì)胞易聚集復(fù)雜15100有限分化敏感有2030胞內(nèi)低90酶、生物堿、天然色素、有機(jī)化合物等110可以簡單0.55無一般有1001000胞內(nèi)或胞外高75發(fā)酵食品、抗生素、有機(jī)化合物、酶等1hakl 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的主要危險(xiǎn)之一是微生

5、物污染。設(shè)備、培養(yǎng)基、懸浮系統(tǒng)和操作方法等的復(fù)雜性都易引起微生物污染，這是細(xì)胞培養(yǎng)都存在的一個(gè)普遍問題，在大規(guī)模培養(yǎng)更為嚴(yán)重。 動物細(xì)胞生長十分緩慢，并易為大多數(shù)微生物污染物所破壞。支原體（mycoplasma）對動物細(xì)胞培養(yǎng)的威脅最大，因?yàn)槠涓腥玖?qiáng)且不易檢出。 因此，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)成功的必要條件是要有一個(gè)設(shè)備精良的細(xì)胞庫（cellbank）。在細(xì)胞庫中的冷凍細(xì)胞不受污染。 動物細(xì)胞培養(yǎng)基的配方十分復(fù)雜，并且還需補(bǔ)充血清和蛋白胨。 原料的質(zhì)量控制和培養(yǎng)基的生產(chǎn)是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題。因?yàn)檠鍋碓蠢щy，質(zhì)量不穩(wěn)定，殘留血清給產(chǎn)物提純帶來困難等。雖然可采用無血清培養(yǎng)基，但在無血清培養(yǎng)基中更可

6、能出現(xiàn)細(xì)胞毒。因此，與培養(yǎng)物相接觸的水必須采用高純度的水。 培養(yǎng)基一般需經(jīng)膜過濾器過濾。可保證其無菌狀態(tài)，但支原體也可被0.1m的過濾膜濾出。 目前，利用動物細(xì)胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)的有用產(chǎn)品大致可分為4大類：（1）疫苗 如狂犬病疫苗、麻疹疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗等。（2）干抗素 如-干擾素和-干擾素等。（3）單克隆抗體 如抗綿羊紅細(xì)胞單克隆抗體等。（4）遺傳重組產(chǎn)品 如人生長激素、免疫球蛋白等。（1）生長速率慢，易為微生物等污染，但可采用在培養(yǎng)基中加入抗生素等措施；（2）細(xì)胞個(gè)體大且無壁，對環(huán)境敏感，因此應(yīng)慎重解決供氧（攪拌與通風(fēng)）與細(xì)胞脆弱的矛盾；（3）設(shè)備放大是一新課題，不能完全按照微生物反應(yīng)過程

7、的經(jīng)驗(yàn)；（4）反應(yīng)過程成本高，主要用于高附加值產(chǎn)物的生產(chǎn)。動物細(xì)胞培養(yǎng)過程的特征動物細(xì)胞培養(yǎng)過程的特征5.1.2 植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性 1902年，德國植物學(xué)家g.haberlandt就預(yù)言植物細(xì)胞培養(yǎng)的可能性。 1937年前后，法國和美國科學(xué)家分別成功的進(jìn)行了胡蘿卜和煙草的組織培養(yǎng)。 1966年klein指出，能利用植物細(xì)胞培養(yǎng)物代替收集或栽培植株來生產(chǎn)生化制品。 近40年來，植物細(xì)胞培養(yǎng)研究成功的例子已有不少，如用紫草懸浮培養(yǎng)物生產(chǎn)紫草寧；煙草細(xì)胞的大量培養(yǎng)等等。 與微生物相比，植物細(xì)胞具有的特性與微生物相比，植物細(xì)胞具有的特性細(xì)胞大，細(xì)胞壁以纖維素為主要成分，耐拉不耐扭，

8、抗剪切能力低；與動物細(xì)胞培養(yǎng)類同，生長速率慢，為防止培養(yǎng)過程中染菌，需加抗生素；細(xì)胞培養(yǎng)需氧，而培養(yǎng)液粘度大，且不能強(qiáng)力通風(fēng)攪拌；產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)且產(chǎn)量低；細(xì)胞常生長成各種大小的團(tuán)塊，增加了懸浮培養(yǎng)的難度等。 20世紀(jì)90年代以來，伴隨著紫杉醇的研究成功并應(yīng)用于臨床，植物細(xì)胞培養(yǎng)及其次級代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)入了新的發(fā)展時(shí)期，尤其是誘導(dǎo)子、前體飼喂、兩相法培養(yǎng)、質(zhì)體轉(zhuǎn)化、毛狀亙和冠癭瘤組織培養(yǎng)等新技術(shù)和新方法的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展，更顯示了植物細(xì)胞培養(yǎng)工程制藥的廣闊發(fā)展前景。 另外，將固定化技術(shù)應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)中的研究對有效的改善植物細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的不足有一定成效。可以認(rèn)為，固定化技術(shù)是有可能在植物細(xì)胞培養(yǎng)中得

9、以應(yīng)用。5.2 植物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動力學(xué)植物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動力學(xué)5.2.1 動植物細(xì)胞的生長模型一、 碳源與生長模型 微生物反應(yīng)中，細(xì)胞的生長速率與限制性基質(zhì)間的關(guān)系常用monod方程來描述。同理，monod方程也可以用于表達(dá)某些碳源與動植物細(xì)胞生長速率間的關(guān)系。例如，在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，多以蔗糖為碳源，安田曾報(bào)道，煙草細(xì)胞在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長速率與蔗糖濃度的關(guān)系可利用monod方程來表達(dá)，此時(shí)lgkhs/35.2,023.01max。 蔗糖為碳源時(shí)，植物細(xì)胞首先分解蔗糖為葡萄糖和果糖，而后優(yōu)先利用葡萄糖。 分別以果糖或葡萄糖為碳源分批培養(yǎng)煙草細(xì)胞時(shí),前者有：lgkhs/35. 2,02

10、3. 01maxlgkhs/94. 0,038. 01max后者為： 由于動植物細(xì)胞的培養(yǎng)過程是好氧過程，因此，許多科技工作者研究了與細(xì)胞呼吸速率相關(guān)的因素。 例如，人參細(xì)胞培養(yǎng)中，添加椰子汁后細(xì)胞的生長速率加快，耗氧量較不添加椰子汁時(shí)明顯增大。 另外，也有報(bào)道，acerpsedoplatanus 細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞體內(nèi)的含氮量與耗氧量有正比例關(guān)系。二、二、 呼吸與生長模型呼吸與生長模型 加藤等所獲得的煙草細(xì)胞分批培養(yǎng)的結(jié)果表明：當(dāng)氧為細(xì)胞生長的限制性因素時(shí)， 與qo2有與上式相似的關(guān)系。說明植物細(xì)胞培養(yǎng)中氧的消耗，部分用于維持代謝，部分用于生長繁殖，所獲得的 一般好氧微生物的比生長速率與菌體的

11、維持常數(shù)m及氧的比消耗速率qo2有如下關(guān)系：氧氧mmolgyhgmmolm/061.0),/(09.0ymqo2這可能是植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的重要特性。與一般微生物的m 和y值相比，m 很小而y較大。三、胞內(nèi)物質(zhì)與生長模型三、胞內(nèi)物質(zhì)與生長模型 微生物培養(yǎng)中，把細(xì)胞內(nèi)rna含量作為描述其生長速率的指標(biāo)。且隨微生物比生長速率的增加，rna含量增大。在植物細(xì)胞的培養(yǎng)中也有類似的報(bào)道。吉田等在進(jìn)行人參細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在對數(shù)生長期，細(xì)胞的rna含量顯著增大。 培養(yǎng)煙草細(xì)胞時(shí)，人們詳細(xì)研究了細(xì)胞的比生長速率與細(xì)胞內(nèi)rna的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與一般微生物相似，可以用一次方程表達(dá)。即：2536rna 綜上所述，動植

12、物細(xì)胞生長動力學(xué)的研究，在很大程度上是借鑒于微生物反應(yīng)動力學(xué)理論。5.2.2 植物細(xì)胞的培養(yǎng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)一、一、植物細(xì)胞的培養(yǎng)操作植物細(xì)胞的培養(yǎng)操作培養(yǎng)方式： 根據(jù)所處狀態(tài)的不同，分為懸浮培養(yǎng)與固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)法， 根據(jù)操作方式的不同，又分為分批式、反復(fù)分批式和連續(xù)式培養(yǎng)3種。 植物細(xì)胞的分批培養(yǎng)與微生物的分批培養(yǎng)類同。由于操作簡單，從實(shí)驗(yàn)室到大型罐廣泛應(yīng)用。 分批培養(yǎng)中，植物細(xì)胞的生長曲線一般呈s型，可明顯觀察出誘導(dǎo)期、對數(shù)生長期、減速期、靜止期和衰亡期。但是與細(xì)菌和酵母菌的培養(yǎng)相比，即使是生長速率快的煙草細(xì)胞，分批培養(yǎng)時(shí)間（一個(gè)周期）也要6天以上，生長緩慢。1、分批培養(yǎng)、分批培養(yǎng) 生物

13、種類生物種類 (h-1) 平均時(shí)代時(shí)間平均時(shí)代時(shí)間 (h) 煙草 0.0320.04 21.717.3 番茄 0.0140.026 49.526.7 人參 0.021 33.0 釀酒酵母 0.50.65 1.391.07 紅曲霉 0.125 5.54 植物與微生物細(xì)胞生長速率的比較植物與微生物細(xì)胞生長速率的比較 目前，無論在實(shí)驗(yàn)室還是在工廠中，大至20噸罐，廣泛采用分批式操作。 藤田開發(fā)的二步培養(yǎng)法是分批培養(yǎng)法的一種變形，同時(shí)使用兩個(gè)反應(yīng)器，第一個(gè)反應(yīng)器主要是為大量培養(yǎng)細(xì)胞，第二個(gè)反應(yīng)器是為增加目的產(chǎn)物的含量。 分批培養(yǎng)中，在一定范圍內(nèi)增加底物濃度，可增加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，但濃度過高又會造成接種

14、細(xì)胞的死亡。 若反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液體積為v，補(bǔ)加量為f（等于取出量），則比值f/ v稱為替換率d。d與連續(xù)培養(yǎng)中的稀釋率d不同，其與培養(yǎng)液取出至加入完成期間的比生長速率有如下關(guān)系：0ln1xxtt)exp(1tvfd 在上式中，xt和x0分別為時(shí)間t=t和t=0時(shí)的細(xì)胞濃度。硅地的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反復(fù)分批培養(yǎng)的生長速率dx要大于分批培養(yǎng)時(shí)的生產(chǎn)速率。2、反復(fù)式分批培養(yǎng)、反復(fù)式分批培養(yǎng) 植物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)與微生物的連續(xù)培養(yǎng)相同，對于一單罐連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，與細(xì)胞生長相關(guān)的物料衡算式為：fxdtdxvdtdxv生長 v 培養(yǎng)液體積 x 細(xì)胞濃度 t 時(shí)間 f 培養(yǎng)液的流加速率3、連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)根據(jù)比生長

15、速率和稀釋率的定義，上式變形為：)(dxdtdx(5-7) 穩(wěn)定狀態(tài)下，=d，細(xì)胞生長速率為xd。畦地等人使用20噸罐，連續(xù)66天培養(yǎng)煙草細(xì)胞by-2，細(xì)胞的生長速率 xd = 5.82g/(ld) 。 一般連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)率高于分批培養(yǎng)的，但由于植物細(xì)胞生長速率慢，維持長時(shí)間的無菌狀態(tài)是需要解決的基本技術(shù)問題。另外，單罐連續(xù)培養(yǎng)法并不能適應(yīng)各種反應(yīng)，因此，有必要開發(fā)一些新的方法。5.3、 動物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動力學(xué)動物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動力學(xué)5.3.1 動物細(xì)胞培養(yǎng)方法動物細(xì)胞培養(yǎng)方法 培養(yǎng)方法有兩種類型： 非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)：來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞（包括雜交瘤細(xì)胞）和某些轉(zhuǎn)

16、化細(xì)胞屬于這一類型，其可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。 貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)：大多數(shù)動物細(xì)胞，包括非淋巴組織的細(xì)胞和許多異倍體體系的細(xì)胞屬于這一類型，它們需要附著于適量正電荷的固體或半固體的表面上生長。 能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的動物細(xì)胞是一類能無限繁殖的細(xì)胞，這樣的細(xì)胞又稱為確立細(xì)胞株。 由于動物細(xì)胞對剪切力的敏感，豐富培養(yǎng)基容易形成過多泡沫，這都增加了反應(yīng)器操作的難度。 懸浮培養(yǎng)多采用分批式操作方法，其原理與植物細(xì)胞的類同。 另外，適用于動物細(xì)胞的還有一種連續(xù)式操作方法 灌流培養(yǎng)法。這種方法是把細(xì)胞置于某種封閉系統(tǒng)中，連續(xù)注入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，連續(xù)等量排出用過的培養(yǎng)基，但不排出懸浮的細(xì)胞。

17、采用這種方法后，從產(chǎn)物開始分泌時(shí)起，便可用快速純化方法不斷的從流出培養(yǎng)基中收集目的產(chǎn)物。 雖然灌流培養(yǎng)系統(tǒng)具有如上優(yōu)點(diǎn)，但也存在培養(yǎng)基消耗量比一般懸浮培養(yǎng)高幾倍，工作過程復(fù)雜，培養(yǎng)物易受污染和培養(yǎng)細(xì)胞不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。 灌流培養(yǎng)系統(tǒng)可分為灌流培養(yǎng)系統(tǒng)可分為3 3類：類：（1）微小均質(zhì)系統(tǒng)，如灌流懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，微載體系統(tǒng)。（2）巨大均質(zhì)系統(tǒng)，如把細(xì)胞包埋在微小球或凝膠中。（3）非均質(zhì)系統(tǒng)，如邊灌流邊用過濾膜將細(xì)胞加以固定。 上述灌流培養(yǎng)方法屬于微小均質(zhì)系統(tǒng)中的灌流懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。 大多數(shù)動物細(xì)胞需附著在固體或半固體表面生長，生長的細(xì)胞最終擴(kuò)展成一單層，所以這種貼壁依賴培養(yǎng)有時(shí)又稱為單層培養(yǎng)。 動物細(xì)胞

18、能否在載體表面上附著生長以達(dá)到擴(kuò)展成一單層的目的，取決于細(xì)胞的特性、載體的理化性質(zhì)以及培養(yǎng)基成分。 例如，瓊脂糖熔融后的冷卻速率慢，使凝膠緩慢生成，則瓊脂糖形成雙螺旋似纖維型結(jié)構(gòu)，能支持細(xì)胞在其表面上附著生長。相反，冷卻迅速的瓊脂凝膠不能支持細(xì)胞在起表面上附著生長。 從操作方式看，貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)可采用分批、半連續(xù)和連續(xù)等多種方法，其原理與植物細(xì)胞培養(yǎng)的類同。 從目前實(shí)用的角度看，主要采用中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)系統(tǒng)。其操作方式多采用灌流式操作，前者屬于非均質(zhì)灌流培養(yǎng)系統(tǒng)，而后者則屬于微小均質(zhì)的灌流培養(yǎng)系統(tǒng)。其反應(yīng)系統(tǒng)的特點(diǎn)請見反應(yīng)器一章。 動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)動力學(xué)同植物細(xì)胞反應(yīng)動力學(xué)，不再敘述。1、簡述動、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)與難點(diǎn)，并與微生物細(xì)胞培養(yǎng)相比較。2、植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)包括哪幾方面內(nèi)容。3、影響植物次生代謝產(chǎn)物積累的因素有那些？4、試比較植物細(xì)胞培養(yǎng)中采用不同生物反應(yīng)器系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)。5、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求與獲得方法。6、動物細(xì)胞培養(yǎng)的方法及要點(diǎn)。7、