組織芯片技術(shù)探討ERK1和p16在胃腸間質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減組織芯片技術(shù)探討ERK1和p16在胃腸間質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義(作者：單位：郵編：)作者：鐘安菁， 吳建農(nóng)，俞薇薇【摘要】目的： 應(yīng)用組織芯片技術(shù)探討細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1(ERK1 )與p16在胃腸間質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及兩種蛋白間的相關(guān)性。方法：采用免疫組化Maxvision法檢測40例胃腸間質(zhì)瘤和40例正 常對照組中ERK1和p16的表達(dá)情況。結(jié)果：ERK1在胃腸間質(zhì)瘤 組中的表達(dá)水平高于正常對照組，而p16表達(dá)情況相反(P V 0.032); 未發(fā)現(xiàn)ERK1與p16之間有明確相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：ERK1與p16可能參與了胃腸間質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程；組織芯片技術(shù)可用

2、于大規(guī) 模高效檢測臨床樣本，具快速、方便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的特點(diǎn)?！娟P(guān)鍵詞】 胃腸間質(zhì)瘤；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1 ; p16 ;組織芯 片Abstract Objective: To investigate the expression and correlati on betwee n extracellular sig nal_ regulated ki nase(ERK1) and p16 in gastrointestinal stromal tumor by tissue chip. Methods The expressions of ERK1 and p16 were examined

3、by the maxvision method in 40 GISTs and 40 normal in contrast group. Results : The expression of ERK1 was higher in GISTs than in the contrast group, while the expression of p16 was higher in the con trary. There was no obvious relatio n betwee n ERK1 and p16. Conclusion : ERK1 and p16 may play a ro

4、le in the development of GIST; the tissue chip is convenience, economic and reliable in large amount of testi ng samples.Key words gastrointestinal stromal tumor; ERK1; p16; tissue chip胃腸間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST )是源于消化道 最常見的間葉組織腫瘤，多數(shù)特異性表達(dá)CD117蛋白(dkit受體，干細(xì)胞生長因子受體)。目前研究認(rèn)為GIST的發(fā)生與ckit基因

5、突變 有關(guān)，該基因突變后，引起細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變而導(dǎo)致細(xì)胞存活、增 殖與分化1。CD117突變后，可通過一系列大分子相互作用引起 級聯(lián)反應(yīng)。目前研究最多的是 rtkrasmapk途徑。細(xì)胞外信號調(diào) 節(jié)激酶(extracellular signal _regulated kinase ，ERK)通路是 MAPK 中的通路之一。ERK通路是受外界刺激時決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵性因 素，它的活化是將信號從表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核的關(guān)鍵步驟，其持續(xù)性活化最終促進(jìn)了細(xì)胞的不斷增殖和轉(zhuǎn)化1 腫瘤的發(fā)生是一個多因 素多步驟的過程，除原癌基因的激活外，腫瘤抑制基因的失活也起著 重要的作用。p16基因又稱多腫瘤抑制基因(mu

6、ltiple tumor suppressor I , MTSl),對正常細(xì)胞周期具有調(diào)控作用，主要通過與 細(xì)胞周期素D( cyclin D)競爭性結(jié)合細(xì)胞周期素依賴性激酶 4或6(CDK4/6)，并抑制其功能，使Rb保持低磷酸化或非磷酸化的活性 狀態(tài)，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞的無限增殖3。有學(xué) 者研究發(fā)現(xiàn)GIST中存在9號染色體缺失，認(rèn)為這可能和 GIST的惡 性轉(zhuǎn)化有關(guān)4。本研究采用組織芯片技術(shù)分析 ERK1和p16在胃 腸間質(zhì)瘤中的表達(dá)，進(jìn)一步探討其在該腫瘤中的可能發(fā)病機(jī)制及意 義，為臨床研究提供一定的理論資料。1材料與方法1.1材料收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科、江西省腫瘤醫(yī)

7、院病理科、江西 省人民醫(yī)院病理科2004年9月2005年10月間手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng) 兩名以上有經(jīng)驗(yàn)的病理專家結(jié)合臨床、大體、鏡下和免疫組化結(jié)果診 斷為胃腸間質(zhì)瘤病例40例。根據(jù)WHO2000消化系統(tǒng)腫瘤分類及文 獻(xiàn)5分為低度危險組11例、中度危險組11例、高度危險組18 例；并以40例取自胃腸道腫瘤大體標(biāo)本腫瘤遠(yuǎn)端肌層組織作為正常 對照組。所有標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。 40例標(biāo)本 來源患者中男性19例，女性21例。1.2主要試劑兔多克隆抗體ERK1，工作濃度1 ：00，購自北京中杉金橋生物技 術(shù)有限公司；鼠抗人單克隆抗體 P16/MIS1，即用型快速免疫組化 Maxvision檢測

8、試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法胃腸間質(zhì)瘤組織芯片的構(gòu)建和制備：將收集的40例胃腸間質(zhì)瘤和 40例正常對照標(biāo)本制成組織芯片。組織芯片的基本制作過程：芯 片的設(shè)計；根據(jù)設(shè)計將受體蠟塊進(jìn)行打孔，孔徑大小與供體組織鉆 取孔徑大小一致；對供體組織HE切片作形態(tài)學(xué)觀察并在供體蠟塊 上準(zhǔn)確標(biāo)記所需要的靶點(diǎn)；利用打孔儀鉆取靶點(diǎn)組織，并轉(zhuǎn)移至受 體蠟塊相應(yīng)的孔位上，制成所需的陣列蠟塊。將制成的組織芯片制成4呵 切片，常規(guī)脫蠟水化；3%過氧化氫 滅活內(nèi)源性過氧化物酶；高溫蒸汽輔助檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)（CD117抗體為EDTA緩沖液修復(fù)）約5 min ;滴加一抗，室溫下 孵育60 min ；

9、PBS漂洗，滴加即用型 MaxvisionTM試劑，室溫下孵 育15 min ； DAB顯色，蘇木素染胞核，鹽酸乙醇分化、脫水透明， 中性樹膠圭寸片。1.4結(jié)果判斷ERK1以細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈明確的棕黃色尤其是核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為細(xì) 胞陽性染色。ERK1以陽性細(xì)胞數(shù)V 30%為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)30% 為陽性6。p16以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為細(xì)胞陽性， 僅細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核著色，以及顯色強(qiáng)度與背景無差別為陰性。p16于 5個高倍鏡視野（X 40 ）中，各計數(shù)100個細(xì)胞，按切片中陽性細(xì)胞 的比例劃分，陽性細(xì)胞數(shù)10%為陽性71.5統(tǒng)計學(xué)方法本資料屬于計數(shù)資料，用SPSS11.5軟件處理。首先采用檢

10、驗(yàn), 比較在GIST組和對照組中ERK1,p16的表達(dá)水平有無差異；若有差 異，則進(jìn)一步用行X列表資料的x2檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)組內(nèi)低、中、高度危 險組中ERK1,p16表達(dá)有無差異；若有差異則用x 2分割法來兩兩比 較這3組之間的差異。以雙側(cè) PV 0.05，單側(cè)Pv 0.032為有統(tǒng)計學(xué) 意義。2結(jié)果2.1胃腸間質(zhì)瘤組與正常對照組中 ERK1與p16的比較ERK1以核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。p16以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核 內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá) （圖1）。40例GIST中有24例ERK1 表達(dá)陽性，12例p16表達(dá)陽性，與對照組中兩種蛋白表達(dá)的差異有 統(tǒng)計學(xué)意義（P0.032 ）（表1），表明ER

11、K1和p16參與了 GIST的發(fā) 生發(fā)展過程。表1 GIST組與對照組中ERK1與p16的表達(dá)情況2.2不同級別胃腸間質(zhì)瘤中ERK1與p16比較本次研究未發(fā)現(xiàn)ERK1和p16在不同級別GIST組中表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05 ）（表2，3）。表2不同級別GIST中ERK1和p16的表達(dá)情況表3低、中度組合并后ERK1和p16的表達(dá)情況2.3胃腸間質(zhì)瘤中ERK1,p16之間的相關(guān)性對40例GISTs中ERK1和p16之間的表達(dá)關(guān)系進(jìn)行線性相關(guān)分析，r=0.274,P0.05，未發(fā)現(xiàn)兩者之間有明確的相關(guān)性。3討論人們認(rèn)為異常的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對促進(jìn)惡性腫瘤的形成起到了至關(guān)重要的作用8。其中酪氨酸

12、激酶系統(tǒng)也許是細(xì)胞調(diào)控當(dāng)中最關(guān)鍵的分子信號系統(tǒng)之一 9。現(xiàn)已證實(shí)大部分GIST中存在Ckit基因 的突變。突變后的KIT受體持續(xù)性活化，其下游的 RAS蛋白也被活 化，活化的RAS激活一個重要的通路絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK )通路。MAPK通路是真核細(xì)胞介導(dǎo) 細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的生長、分化、分裂、死亡以及細(xì)胞間的功能同步化等多種過程10 在真核細(xì)胞中已確定 MAPK有4條信號通路，其中了解得最為清楚 的一條是 ERK通路。ERK通路包括 ERK1 (p44MAPK )和ERK2 (p

13、42MAPK )通路，兩者功能相似。ERK是受到外界刺激時決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵性因素，它能促進(jìn)增殖，決定細(xì)胞向終末期分化或發(fā)生 凋亡。ERK的活化是將信號從表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核的關(guān)鍵步驟，其持 續(xù)性活化最終促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化1 本實(shí)驗(yàn)觀察到 ERK1 在GIST組中的表達(dá)水平高于對照組中的表達(dá)水平，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明ERK1參與了 GIST的發(fā)生發(fā)展過程。我們未發(fā)現(xiàn) ERK1 在不同級別GIST中的表達(dá)差異，這與某些文獻(xiàn)報道較一致11 p16基因位于人 9p21，又稱多腫瘤抑制基因 I ( multiple tumorsuppressor I, MTS_I)，其編碼產(chǎn)物p16蛋白，是細(xì)胞周

14、期的有效調(diào) 控者，又是抑制腫瘤細(xì)胞生長的關(guān)鍵因子12 在人類多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)p16基因異常，表現(xiàn)為缺失或突變。其表 現(xiàn)特點(diǎn)以基因缺失為主，且多為純合子丟失。不同腫瘤突變頻率不同， 同一腫瘤的不同分化程度其缺失和突變率也不同。關(guān)于p16基因在GIST形成中的作用，眾多學(xué)者的研究認(rèn)為p16基因參與了 GIST的 發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究觀察到p16在GIST組中的表達(dá)水平高于對 照組中的表達(dá)水平，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明p16參與了 GIST的 發(fā)生發(fā)展過程。我們未發(fā)現(xiàn)p16在不同級別GIST中的表達(dá)差異，這 與某些文獻(xiàn)報道較一致11。理論上，ERK通路活化可使胞內(nèi)cyclin D合成增多。而p16則

15、通 過與cyclin D競爭，結(jié)合并抑制CDK4/6，使之不能解除Rb基因?qū)?轉(zhuǎn)錄因子的抑制，從而抑制細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞生長。在正常的細(xì)胞 周期中，細(xì)胞的增殖與抑制是受到精密調(diào)控的。但是在致瘤因子的長 期刺激下，ERK通路被持續(xù)性活化，細(xì)胞處于不斷的分裂增殖狀態(tài)。 細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)的cyclin D及cyclin DCDK4/6復(fù)合物也將刺激 p16基因的表達(dá)，競爭性抑制 CDK4/6的活性。然而，p16基因是腫 瘤中目前所知最常發(fā)生改變的基因，主要表現(xiàn)為缺失或突變或甲基化 而失活。導(dǎo)致p16基因發(fā)生突變的原因未明，而 ERK與p16之間的 關(guān)系目前也無統(tǒng)一的觀點(diǎn)。有的認(rèn)為 ERK信號通路活化

16、可誘導(dǎo)p16 等抑癌基因表達(dá)，有的發(fā)現(xiàn) ERK通路活化常伴有p16基因缺失，而 有的則認(rèn)為ERK通路活化與p16表達(dá)間無明確聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)未觀察 到ERK1與p16之間有何明確的關(guān)系，這與某些文獻(xiàn)報道不一致， 可能與收集標(biāo)本數(shù)有限有關(guān)。兩者之間的關(guān)系有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究采用組織芯片技術(shù)研究 GIST中ERK與p16的表達(dá)情況， 并初步探討其意義。組織芯片特點(diǎn)是體積小，信息含量大，一次性實(shí) 驗(yàn)即可獲大量結(jié)果，可做 HE染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色、 DNA和RNA原位雜交、熒光原位雜交。組織芯片蠟塊可做100200張連續(xù)切片，這樣用同一套組織芯片即可迅速地對上百種生物分子標(biāo) 記(如抗原、

17、DNA和RNA )進(jìn)行分析、檢測，因而備受組織病理學(xué) 家的重視。我們制作了 80例GIST的組織芯片，其中GIST40例， 正常消化道管壁肌組織40例。每張組織芯片上樣品排列整齊，外形 為圓形或類圓形，較少有皺折和掉片現(xiàn)象。僅用幾張芯片即完成了全 部實(shí)驗(yàn)，極大地節(jié)約了研究經(jīng)費(fèi)并降低了勞動量，在最短的時間內(nèi)獲得了 GIST中ERK1和p16 K表達(dá)的全部數(shù)據(jù)。因此，應(yīng)用組織芯片 大規(guī)模高效檢測臨床組織樣本是可行的，具有快速、方便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn) 確的特點(diǎn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Haller F, L bke C, Ruschhaupt M, et al.Increased KIT signalling wi

18、th up_regulation of cyclin D correlates to accelerated proliferation and shorter disease free survival in gastrointestinal stromal tumours (GISTs) with KIT exon 11 deletions J . J Pathol,2008,216(2):225-235.:2凌暉，蘇琦.MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤細(xì)胞分化J.國外醫(yī)學(xué)：生理、病理與臨床分冊，2003,23 (5): 487-489.3 Goldblum TR, Appelman HD. S

19、tromal tumors of theduodenum:A histologic and immunohistochemical study of 20 cases J . Am J Surg Pathol, 1995,19(1): 71-80.4 Berman J, O Leary TJ. Gastrointestinal stromal tumors workshop J . Hum Pathol, 2001,32(6): 578-582.5 D Amato G, Stei nert DM, McAuliffe JC, et al. Update on the Biology and t

20、herapy of Gastrointestinal Stromal Tumors J . Can cer Con trol, 2005,12(1):44-56.6 King TJ, Lampe PD. Mice deficie nt for the gap jun cti on prote inConnexin 32 exhibit in creasedradiati on in ducedtumorigenesis associated with elevated mitogen activated protein kin ase(p44/Erk1,p42/Erk2)activati on J . Carcinogen esis,2004,25(5):669-680.7 Brewer RH, Sn ijders PJ, Sutedja GT, et al. Expressi on of the p16INK4a gene product, methylation of the p16INK4a promoter region and expression of the polycombgroup gene BMI 1in s