果膠酶應(yīng)用基理及活性檢測(cè)方法

1、果膠酶應(yīng)用基理及活性檢測(cè)方法2013-1-23 16:57:21隨著人們對(duì)健康環(huán)保紡織品需求的增加以及各國(guó)政府對(duì)環(huán)境保護(hù)強(qiáng)制力度的加大，在紡織印染行業(yè)中一種新型的紡織助劑生物酶制劑的應(yīng)用逐漸發(fā)展起來(lái)。目前，一種基于果膠酶的新型紡織生物助劑正在應(yīng)用推廣中，它主要用于棉、麻的前處理工藝。由于紡織企業(yè)多數(shù)對(duì)果膠酶的生物特性不甚了解，在工藝應(yīng)用過(guò)程中缺乏相應(yīng)的檢測(cè)手段，使其推廣受到限制。酶活力（活性）是衡量酶生物活性及含量的重要指標(biāo)，因此，建立適用于紡織行業(yè)的果膠酶酶活檢測(cè)方法，是十分迫切和必要的。2果膠酶的酶促作用機(jī)理果膠酶是一類復(fù)合酶，是指分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱。我們測(cè)定的酶活值通常是這一 類復(fù)

2、合酶協(xié)同作用的綜合結(jié)果。果膠酶可分為兩大類：解聚酶和果膠酯酶。解聚酶主要是通過(guò)水解作用和反式消去作用，切斷果膠和果膠酶分子a-1,4糖苷鍵，將果膠分子降解為小分子。果膠酯酶的作用是使果膠分子中的甲酯水解，最后形成果膠酸。果膠質(zhì)主要是由D -半乳糖醛酸以a1,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物。部分D-半乳糖醛酸上的羧基被甲醇酯化、形成甲酯，或被一種或多種堿部分或全部中和。果膠質(zhì)在植物的細(xì)胞組織中起著粘合”作用，在棉纖維的初生胞壁中，果膠質(zhì)含量約占9%，而麻纖維則更高。通過(guò)果膠酶的作用，將果膠質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，從纖維中游離出來(lái)，可使與其粘合在一起的其它雜質(zhì)（如蠟質(zhì)、蛋白質(zhì)、灰份等）與纖維素徹底分開(kāi)

3、，達(dá)到棉精煉或麻脫膠的目的。對(duì)于紡織行業(yè)，需要的是將果膠催化水解成可游離出纖維的、小分子物質(zhì)的果膠酶活性（力），因此，主要測(cè)定解聚酶的活力。解聚酶對(duì)果膠分子的酶促催化作用表現(xiàn)為，每切斷一個(gè)果，即可膠分子的 a-1,4糖苷鍵，就會(huì)形成一個(gè)還原性醛基。通過(guò)測(cè)定這些還原性醛基生成的量 判定解聚酶的酶活力。3測(cè)定酶活力 （性 ）的基本原理酶作為一種生物催化劑,其酶活力值是與其催化效率及有效（ 即有生物活性 ） 酶的含量相關(guān)的。酶活力是酶在單位時(shí)間內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化為反應(yīng)產(chǎn)物的能力，以U （mol /時(shí)間）表示，底物即是酶催化的反應(yīng)物。通常，酶制劑的活力是以U / g酶制劑（或U/mL酶制劑）表示，把酶制劑的

4、量和活力聯(lián)系在一起，稱為“比活力 ”。在特定條件下 ，通過(guò)測(cè)定單位量的某種酶制劑在單位時(shí)間內(nèi)催化足夠量底物生成反應(yīng)產(chǎn)物的量 ，即可測(cè)出此酶制劑的比活力。根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的米氏學(xué)說(shuō) ，從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā) ，按照“穩(wěn)態(tài)平衡 ”假說(shuō)的設(shè) 想， 可推導(dǎo)出如下公式 :產(chǎn)物生成速率=k 3總酶底物/（底物+ km ）（1）式中:總酶 酶的總濃度 （mol /mL ）;底物 底物濃度 （mol /mL ）;k 3 在酶促反應(yīng)的第二步 ，形成最終產(chǎn)物的速率常數(shù) ;km 米氏常數(shù) （mol /mL ），其值是當(dāng)酶反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底 物濃度。要估計(jì)總酶,首先要固定所有可控制的獨(dú)立變量，如p

5、H值、溫度等。當(dāng)?shù)孜?Km時(shí)，底物對(duì)反應(yīng)速率的影響可忽略（酶飽和），酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速率Vmax，其結(jié)果是：產(chǎn)物生成速率=k 3總酶=Vmax = UU就成為總酶量的一種測(cè)量。因此，可以通過(guò)測(cè)定U來(lái)反映酶制劑中有效酶蛋白的含量。4果膠酶酶活的測(cè)定方法概述和比較測(cè)定果膠酶酶活的方法有很多,但基本上都是利用酶促分解果膠產(chǎn)生的粘度下降或生成的還原性醛基來(lái)測(cè)定果膠酶酶活。 這些方法概括起來(lái)主要有粘度降低法、 滴定法和分光光度 法3種。本文分別選取一種較典型的測(cè)定方法加以介紹。4.1 粘度降低法4.1.1 原理果膠溶于水后形成粘稠狀溶液,其粘度和溶解度與其聚合和酯化程度有關(guān)?？梢岳霉z的這種性質(zhì)

6、, 測(cè)其酶活力。即在一定溫度、酶濃度下和一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi) , 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)果膠溶液 粘度的降低率。4.1.2 操作方法浴中保溫10 min后，加入1mL酶液，繼續(xù)保溫,在不同時(shí)間分別測(cè)定反應(yīng)混合液流出粘 度計(jì)小球的時(shí)間。對(duì)照實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)熱處理已失活的酶液。4.1.3 計(jì)算粘度下降百分?jǐn)?shù)可用下式表示 :粘度下降()=100( To - T )/( To -T (2)式中：T、To和T a分別為反應(yīng)混合液、對(duì)照混合液和緩沖液的流出時(shí)間(s )。酶溶液要預(yù)先稀釋，使粘度降低范圍在20%80%。在此范圍內(nèi)，酶濃度對(duì)數(shù)與粘度降低 率成正比。以酶作用時(shí)間為橫坐標(biāo)、粘度下降百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，在圖中查出粘度下

7、降50%時(shí)對(duì)應(yīng)酶的作用時(shí)間(T 1/2)。在上述條件下，引起粘度下降50%的酶量為10個(gè)果膠 酶活力單位 ，即酶活單位 =10/( T 1/2/3600) 。4.2滴定法4.2.1 原理果膠酶徹底水解果膠 ,生成半乳糖醛酸 ;半乳糖醛酸可與碘 (過(guò)量 )反應(yīng)。反應(yīng)后剩余的碘可用硫代硫酸鈉溶液滴定 ,據(jù)此可得出酶解反應(yīng)產(chǎn)生的半乳糖醛酸的量。以生成半乳糖醛酸 的量衡量果膠酶的活力。4.2.2 測(cè)定方法取1%果膠溶液10 mL，加入到5 mL酶液和5 mL水，調(diào)pH至3.5,在50 C水浴中保持2 h ,取出加熱煮沸。冷卻后，取5mL反應(yīng)液移入碘量瓶中，加1 M碳酸鈉溶液1 mL ,0.1 N碘液5

8、 mL ,搖勻，加塞,于室溫下放置20 min，加2N硫酸2 mL，用0.05 N硫代硫酸鈉滴定至淡黃 色，加0.5%淀粉指示劑1 mL ,繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為止。記錄所消耗的硫代硫酸鈉毫升數(shù)A?？瞻自囼?yàn)用10 mL果膠溶液、10 mL水，不加酶液，不經(jīng)保溫，直接取此混合物5 mL于100 m L三角瓶中用于滴定，記錄消耗的硫代硫酸鈉毫升數(shù)E。4.2.3計(jì)算在上述條件下,1 h酶促轉(zhuǎn)化果膠、生成1 mg當(dāng)量游離半乳糖醛酸所需的酶量定為一個(gè)酶活單位。每毫升酶液的活力單位 =(B - A )N 0.51 20.(5 X2 0)(3)式中 :N 硫代硫酸鈉的當(dāng)量濃度 ;0.511 mg當(dāng)量硫代硫酸鈉

9、相當(dāng)于0.51 mg當(dāng)量的半乳糖醛酸；20 分解果膠反應(yīng)液的總體積數(shù);5、 2、 5 分別表示反應(yīng)中加入酶液的毫升數(shù)、反應(yīng)時(shí)間、滴定時(shí)所取反應(yīng)液的毫 升數(shù)。4. 3分光光度法4.3.1 原理果膠酶分解果膠 ,產(chǎn)生帶有還原性醛基的還原糖（以半乳糖醛酸計(jì) ）,一些顯色劑可與其發(fā)生顯色反應(yīng)。根據(jù)顏色深淺的不同,可以通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定果膠酶酶活值的大小。本文以最常用的DNS比色法介紹此檢測(cè)方法，其顯色劑為3,5-二硝基水楊酸。4.3.2 操作方法取0.5%果膠溶液0.5 mL加入到0.5 mL酶液中，搖勻。在50 C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)0.5 h ,取 出后，迅速在沸水浴中加熱5 min ,冷卻。取0.5

10、mL反應(yīng)液移入加有 0.5 mLDNS試劑的試 管,加4mL蒸餾水，搖勻，在沸水浴中加熱5min ,迅速冷卻。用分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)其 吸光度值。參比液配制：加熱滅活5 min的0.5 mL的稀釋酶液與0.5 mL 0.5%果膠溶液充分 混合。4.3.3計(jì)算采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，在540 nm處測(cè)定吸光度（A ）,以葡萄糖濃度（C ）為橫坐標(biāo)、吸光度（A ）為縱光標(biāo)作A . C標(biāo)準(zhǔn)曲線（參見(jiàn)5.2節(jié)圖2）。由標(biāo)準(zhǔn) 曲線可得公式 ：A =斜率XC （mg葡萄糖/ mL ）（4）未知試液測(cè)定吸光度值A(chǔ)后，可通過(guò)上式求得C （mg葡萄糖/mL ）。在上述條件下，

11、每小時(shí)內(nèi)每毫升果膠酶酶促轉(zhuǎn)化果膠生成1mg當(dāng)量還原糖（以半乳糖醛酸計(jì) ）所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。即：果膠酶活（m g半乳糖醛酸/ m L h ）=酶液稀釋倍數(shù)XC （ m g葡萄糖/ m L） X2 X194/180（5）式中 ：194/180 葡萄糖換算成半乳糖醛酸的量 ;2測(cè)定中稀酶液被 0.5% 果膠溶液稀釋的倍數(shù)。4.43 種方法的比較將粘度降低法用來(lái)測(cè)定果膠酶的復(fù)合酶活力比較準(zhǔn)確,但操作過(guò)程也相對(duì)復(fù)雜 ,且測(cè)定靈敏度不高。滴定法設(shè)備使用簡(jiǎn)單,測(cè)試重現(xiàn)行好 ,準(zhǔn)確度高 ,但測(cè)定時(shí)間長(zhǎng) ,過(guò)程較繁瑣 ,試劑用量較大。 而分光光度法測(cè)定的靈敏度、 準(zhǔn)確度均高 ,重現(xiàn)性好 ,試劑用量少

12、 ,尤其是操作省時(shí)、 簡(jiǎn)便。對(duì)于上述 3 種測(cè)定方法 ,根據(jù)紡織行業(yè)的特點(diǎn) ,筆者認(rèn)為分光光度法更適于紡織工作者 應(yīng)用。下面重點(diǎn)探討DNS比色法在實(shí)際應(yīng)用中的一些具體問(wèn)題。5應(yīng)用DNS比色法測(cè)定果膠酶酶活5.1果膠溶液的配制以及酶液的稀釋 果膠溶液的配制濃度以及酶液的稀釋倍數(shù)是相互聯(lián)系的兩個(gè)數(shù)據(jù),它們的確定對(duì)酶活測(cè)定結(jié)果的正確性起著關(guān)鍵作用。通過(guò)完成以下試驗(yàn),可以確定有關(guān)參數(shù)條件。5.1.1 材料與方法5.1.1.1 儀器與試劑UV 9200分光光度計(jì)；果膠（Sigma卜果膠酶制劑（NOVO卜3,5-二硝基水楊酸、 巴比妥酸、巴比妥鈉。5.1.1.2 溶液配制DNS 試劑：將 6.3 g 3,

13、5-二硝基水楊酸、 262 mL 2 mol / LNaO H加到 500 mL含182 g酒石酸鈉的熱水溶液中,再加5 g苯酚及5 g亞硫酸鈉，待溶解、冷卻后，加蒸餾水定容至 1000mL ,貯于棕色瓶中 ,一周后即可使用。5.1.1.3配制巴比妥緩沖液（pH =8.6）稱取1.84 g巴比妥酸 置于5660 C水中溶化 撚后加入10.3 g巴比妥鈉，加蒸餾水定容至 1000 mLo5.1.1.4配制0.5%果膠溶液準(zhǔn)確稱取0.5 g果膠于燒杯中，用巴比妥緩沖液（pH =8.6）溶解、稀釋定容至100 mLo5.1.2制作果膠酶稀釋倍數(shù)與吸光度關(guān)系曲線分別按表1的稀釋倍數(shù)用蒸餾水稀釋果膠酶，

14、將稀釋酶液按432測(cè)定吸光度值，以果膠酶稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度（A ）為縱坐標(biāo)作關(guān)系曲線（見(jiàn)圖1） o果.阪曲的干同得稈帶數(shù)於相應(yīng)般此康帖図抵什利毓厲厲甜尺M(jìn)l j佛潔為啦朮庫(kù)粧用MO miLW01帕tiSJD5(10.415wa想札汗4WKI0.1戲2(11 網(wǎng)Ur i7O.IDO -11110巒40礎(chǔ)加圖1果膠薊稀釋倍數(shù)與吸光虞A的關(guān)系劇線5.1.3結(jié)果與討論由公式（4）、（5）可得出，在酶活相同的情況下，吸光度與酶液稀釋倍數(shù)的倒數(shù)應(yīng)呈正比例關(guān)系o圖1為試驗(yàn)測(cè)得的果膠酶稀釋倍數(shù)的倒數(shù)與其酶活力吸光度值關(guān)系曲線，從中可看出果膠酶的稀釋倍數(shù)過(guò)低或過(guò)高都會(huì)偏離正比的線性關(guān)系，尤其在稀釋倍

15、數(shù)過(guò)低的情況下。原因可能有以下兩點(diǎn)：根據(jù)米氏學(xué)說(shuō)，底物濃度應(yīng)保持足夠大到使酶飽和，達(dá)到最大反應(yīng)速率，酶,而不能滿足這種正比活值與酶濃度才能成正比。過(guò)高的酶液濃度可能使底物濃度相對(duì)不足關(guān)系。根據(jù)朗伯-比耳定律，吸光度與濃度間只在一定范圍內(nèi)有較好的正比關(guān)系，酶促反應(yīng)產(chǎn)生的高濃度產(chǎn)物與DNS的絡(luò)合物顏色過(guò)深，會(huì)超過(guò)這一范圍產(chǎn)生較大誤差。稀釋倍數(shù)過(guò)高時(shí)吸光度值也偏離朗伯 -比耳定律 ，但仍滿足底物使酶飽和的條件，因此產(chǎn)生的偏差相對(duì)小得多。果膠溶液的配制一定要有足夠大的量，但過(guò)大的果膠濃度又會(huì)使溶液粘度加大，增加操作的誤差。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn),在反應(yīng)30 min條件下確定0.5%的果膠濃度,效果最好。將表1的

16、最 高稀釋倍數(shù)和最低稀釋倍數(shù)的吸光度值刪除 ，對(duì)其它數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到曲線的回歸方程為：A =820.72 C(R 2=0.9943)。表明其線性相關(guān)度很好，說(shuō)明當(dāng)酶制劑稀釋液的吸光度值在0.20.4范圍內(nèi)時(shí)，其酶活值有很高的準(zhǔn)確度。用自產(chǎn)的粗酶液進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)，也得到相同結(jié)果 ( 見(jiàn)表 2) 。因此，可以確定果膠溶液濃度為 0.5%， 控制酶液稀釋倍數(shù)使吸光度值在 0.2 0.4范圍內(nèi)。5.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的 ，也是找到葡萄糖溶液濃度與吸光度最佳線性關(guān)系的范圍。繪制的參考數(shù)據(jù)及結(jié)果見(jiàn)表 3、圖2。由圖 2可見(jiàn)，在此范圍內(nèi) ，曲線有較好的線性關(guān)系。S3埠制X1

17、菊粹炸淮茅進(jìn)散嫌慚戢度口詔.LJ1(Fn1(1a. L%20(I. 2料百Sa. wt6a.75 if鬲麗iKltt標(biāo)準(zhǔn)工柞曲繡:咄陀網(wǎng) |門力押 A-I L4in El -Q. ma本測(cè)定方法采用葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，因?yàn)槠咸烟且椎?，且價(jià)錢便宜。用還原糖作為標(biāo)準(zhǔn) 曲線,是為了標(biāo)定果膠分解產(chǎn)生的還原性醛基的量。在公式（5）的求酶活公式中，有一項(xiàng)葡萄糖與半乳糖醛酸的轉(zhuǎn)換系數(shù)，可換算為以半乳糖醛酸計(jì)。因此，無(wú)論用哪種還原糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果都是相同的。5.3試驗(yàn)溫度和pH范圍酶促反應(yīng)都有最佳反應(yīng)溫度和pH范圍。在最佳酶反應(yīng)范圍內(nèi)，酶作用的活力最高。最佳酶反應(yīng)pH值和溫度的范圍是由酶的自身性質(zhì)、特點(diǎn)所決定的，過(guò)多偏離此范圍會(huì)使酶的活性降低甚至失去活性。因此在測(cè)定果膠酶活性時(shí)，作用溫度和pH值要與其最佳反應(yīng)條件范圍相一致。最佳酶反應(yīng)條件一般會(huì)由酶制劑廠家提供。在紡織領(lǐng)域應(yīng)用的果膠酶，一般以堿性果膠酶為主。本試驗(yàn)應(yīng)用的就是堿性果膠酶，其最佳反應(yīng)條件是溫度 4555 C，pH范圍89。配制果膠酶溶液用巴比妥緩沖液（pH =8.6），在50 C水浴中進(jìn)行酶促反應(yīng)可獲得最佳試驗(yàn)結(jié)果。5.4