第三章外植體選擇和滅菌

1、復(fù)習(xí)題：培養(yǎng)基的成分包括哪幾類？各有何作培養(yǎng)基的成分包括哪幾類？各有何作用？用？在培養(yǎng)基成分中什么決定著外植體發(fā)在培養(yǎng)基成分中什么決定著外植體發(fā)育方向？育方向？抗生素的作用是什么？抗生素的作用是什么？配制配制MSMS培養(yǎng)基時，瓊脂和蔗糖的加培養(yǎng)基時，瓊脂和蔗糖的加入量一般為多少？入量一般為多少？ 第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌第一節(jié)第一節(jié) 外植體的選擇外植體的選擇 第二節(jié)第二節(jié) 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法 第三節(jié)第三節(jié) 污染原因和預(yù)防措施污染原因和預(yù)防措施 第三章第三章 外植體的選擇和滅菌外植體的選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌第一節(jié)第一節(jié) 外植體的選

2、擇外植體的選擇 1 外植體部位外植體部位2 取材季節(jié)取材季節(jié)3 器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡4 選取適宜的大小選取適宜的大小第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌1 外植體部位植物體的各個部位，如莖尖、莖段、皮層及維管組織、植物體的各個部位，如莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細(xì)胞、表皮、塊莖的貯藏薄壁細(xì)胞、花瓣、根、葉、髓細(xì)胞、表皮、塊莖的貯藏薄壁細(xì)胞、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。不同種類的植物以及同一植物的不同器官對誘導(dǎo)條件反不同種類的植物以及同一植物的不同器官對誘導(dǎo)條件反應(yīng)不一致的。應(yīng)不一致的。大多數(shù)植物來說，莖尖是較好的部位，

3、其形態(tài)已基本建大多數(shù)植物來說，莖尖是較好的部位，其形態(tài)已基本建成，生長速度快，遺傳性穩(wěn)定，是獲得無病毒苗的重要成，生長速度快，遺傳性穩(wěn)定，是獲得無病毒苗的重要途徑。途徑。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌外植體選擇的原則外植體選擇的原則培養(yǎng)材料的來源是否保證是否會引起不良變異。培養(yǎng)材料的來源是否保證是否會引起不良變異。葉片的來源最有保證，許多植物的組織培養(yǎng)以葉葉片的來源最有保證，許多植物的組織培養(yǎng)以葉片為外植體。片為外植體。對一些培養(yǎng)較困難的植物，可以通過子葉或下胚對一些培養(yǎng)較困難的植物，可以通過子葉或下胚軸來建立其組織培養(yǎng)再生體系。軸來建立其組織培養(yǎng)再生體系。第三章外植體選擇和滅菌

4、第三章外植體選擇和滅菌2 2 取材季節(jié)取材季節(jié) p在生長開始的季節(jié)取材，若在生長末期或已進(jìn)入休在生長開始的季節(jié)取材，若在生長末期或已進(jìn)入休眠時取樣，則外植體可能對誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無反應(yīng)眠時取樣，則外植體可能對誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無反應(yīng)。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌3 3 器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡植物上部器官的生長時間雖短，其生理年齡植物上部器官的生長時間雖短，其生理年齡卻較老，更接近發(fā)育上的成熟，越容易形成卻較老，更接近發(fā)育上的成熟，越容易形成花器官。而越向基部，則生理年齡越小?；ㄆ鞴?。而越向基部，則生理年齡越小。下部組織越易形成營養(yǎng)器官，上部組織易形下部組織越

5、易形成營養(yǎng)器官，上部組織易形成花器官。成花器官。通常年幼組織比年老組織有較高的形態(tài)發(fā)生通常年幼組織比年老組織有較高的形態(tài)發(fā)生能力，容易培養(yǎng)，有較大的再生能力。能力，容易培養(yǎng)，有較大的再生能力。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌4 選取適宜的大小選取適宜的大小 n 材料太大易污染；材料太小，難于成活。材料太大易污染；材料太小，難于成活。n 0.5cm-1.0cm。n 如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌第三章第三章 外植體的選擇和滅菌外植體的選擇和滅菌 第一節(jié)第一節(jié) 外植體的選擇外植體的選擇 第二節(jié)

6、第二節(jié) 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法 第三節(jié)第三節(jié) 污染原因和預(yù)防措施污染原因和預(yù)防措施 第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌1 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法預(yù)處理：先對植物組織修整，去掉不需要的部分，流水預(yù)處理：先對植物組織修整，去掉不需要的部分，流水中沖洗干凈。中沖洗干凈。預(yù)處理的植物材料的滅菌：預(yù)處理的植物材料的滅菌： 原則：原則：充分滅菌，但不傷外植體充分滅菌，但不傷外植體不同的外植體，滅菌的要求也不一樣不同的外植體，滅菌的要求也不一樣第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌2 常用滅菌藥劑的使用和效果常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑滅菌劑使用濃度使用濃度（%）清除的

7、難易清除的難易消毒時間消毒時間（min）效效 果果次氯酸鈉次氯酸鈉10-30易易530很好很好次氯酸鈣次氯酸鈣2易易530很好很好漂漂 白白 粉粉飽和濃度飽和濃度易易530很好很好氯氯 化化 汞汞0.011較難較難210最好最好酒酒 精精7075易易0.22好好過氧化氫過氧化氫1012最易最易515好好溴溴 水水12易易210很好很好硝硝 酸酸 銀銀1較難較難530好好抗抗 菌菌 素素450mg/L中中3060較好較好第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌常規(guī)的表面滅菌處理方法常規(guī)的表面滅菌處理方法把材料放進(jìn)把材料放進(jìn)70%的酒精中約的酒精中約30s。用用0.1%的升汞（的升汞（HgCl

8、2）中浸泡）中浸泡5-10min。 或用或用10%的漂白粉上清液中浸的漂白粉上清液中浸10min 15min。無菌蒸餾水沖洗無菌蒸餾水沖洗35次。次。滅菌時進(jìn)行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好滅菌時進(jìn)行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好 的接觸。的接觸。在滅菌劑里滴入數(shù)滴在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的的Tween20（吐溫）（吐溫） 或或Tween80濕潤劑，則滅菌效果更好。濕潤劑，則滅菌效果更好。 第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌1）表面消毒劑對植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和）表面消毒劑對植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。處理時間，以減少組

9、織的死亡。2）與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移到無菌基質(zhì)前需將其切除，因為）與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移到無菌基質(zhì)前需將其切除，因為消毒劑會阻礙植物細(xì)胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。消毒劑會阻礙植物細(xì)胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。3）若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗）若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗1小時以上或先種子培養(yǎng)得小時以上或先種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后用其各個部分建立組織培養(yǎng)。到無菌種苗，然后用其各個部分建立組織培養(yǎng)。4）HgCl2效果最好，但對實驗材料的危害最大，要用水沖洗至少效果最好，但對實驗材料的危害最大，要用水沖洗至少5次。次。 消毒注意事項消毒注意事項第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅

10、菌第三章第三章 外植體的選擇和滅菌外植體的選擇和滅菌 第一節(jié)第一節(jié) 外植體的選擇外植體的選擇 第二節(jié)第二節(jié) 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法 第三節(jié)第三節(jié) 污染原因和預(yù)防措施污染原因和預(yù)防措施 第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌第三節(jié)污染原因和預(yù)防措施第三節(jié)污染原因和預(yù)防措施1、污染的原因、污染的原因污染污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌1.1 1.1 污染的原因：污染的原因：從病源菌方面：主要有細(xì)菌及真菌兩大類；從病源菌方面：主要有細(xì)菌及

11、真菌兩大類；從污染的途徑：從污染的途徑： 外植體帶菌外植體帶菌 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 器皿滅菌不徹底器皿滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌1.2 細(xì)菌污染的特點細(xì)菌污染的特點：菌斑呈粘液狀物，而且在接種后菌斑呈粘液狀物，而且在接種后12天即可發(fā)現(xiàn)。天即可發(fā)現(xiàn)。原因：材料帶菌原因：材料帶菌 培養(yǎng)基滅菌不徹底培養(yǎng)基滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規(guī)程操作人員未遵守操作規(guī)程因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70%酒精精擦凈，鑷子酒精精擦凈，鑷子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。

12、第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌1.3 真菌污染的特點真菌污染的特點：污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種后污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種后310天才能天才能發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)。原因：周圍環(huán)境不清潔原因：周圍環(huán)境不清潔 超凈工作臺的過濾裝置失效超凈工作臺的過濾裝置失效 培養(yǎng)用器皿的口徑過大等培養(yǎng)用器皿的口徑過大等為了減少損失，提高工作效率，必須在每個操作環(huán)節(jié)注為了減少損失，提高工作效率，必須在每個操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。意防止污染的發(fā)生。 第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌污染后的措施發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)境

13、污染。境污染。對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更嚴(yán)格對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更嚴(yán)格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進(jìn)要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進(jìn)行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌2 污染的防治措施2.1 防止材料帶菌的措施防止材料帶菌的措施2.2 外植體的滅菌外植體的滅菌2.3 玻璃器皿的滅菌玻璃器皿的滅菌2.4 金屬器械的滅菌金屬器械的滅菌2.5 布質(zhì)制品的滅菌布質(zhì)制品的滅菌2.

14、6 無菌操作室的滅菌無菌操作室的滅菌2.7 操作操作第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌 2.2.1 防止材料帶菌的措施防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時，可在室內(nèi)或無菌條件下對）用莖尖作外植體時，可在室內(nèi)或無菌條件下對 枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。p 枝條插入無糖的營養(yǎng)液或自來水，以新抽嫩枝條作為外枝條插入無糖的營養(yǎng)液或自來水，以新抽嫩枝條作為外植體；植體；p 或暗培養(yǎng)，待或暗培養(yǎng)，待 抽出徒長的黃化枝條時采枝接種。抽出徒長的黃化枝條時采枝接種。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌 （2 2）選擇合適的時間去田間采取外植體）選擇合適的時間去田間采取外植體避免陰雨

15、天去田間采取外植體。避免陰雨天去田間采取外植體。在晴天采取外植體時，下午采取的外植體要比在晴天采取外植體時，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部早晨采的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部分細(xì)菌或真菌分細(xì)菌或真菌。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌 但目前對材料內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅但目前對材料內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅菌方法。菌方法。在菌類長入組織內(nèi)部時，不要去年生的鱗片，在菌類長入組織內(nèi)部時，不要去年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，可以收到一定的防污染效果。織，可以收到一定的防污染效果。第三章外植體

16、選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌2.2 外植體的滅菌外植體的滅菌（1）多次滅菌法：如咖啡成熟葉片的滅菌。）多次滅菌法：如咖啡成熟葉片的滅菌。p除去主脈、葉的頂端、基部和邊緣部分，這樣可大大減除去主脈、葉的頂端、基部和邊緣部分，這樣可大大減少污染；少污染；p消毒處理消毒處理p次日再次消毒次日再次消毒p對層積過的種子也可用多次滅菌法，在種子吸脹前后都對層積過的種子也可用多次滅菌法，在種子吸脹前后都要滅菌，要滅菌，第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌（2 2）多種藥液交替浸泡法）多種藥液交替浸泡法 對容易污染而難滅菌的材料：對容易污染而難滅菌的材料：第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅

17、菌2.32.3 玻璃器皿的滅菌玻璃器皿的滅菌濕熱滅菌法濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌時間可延長滅菌鍋中進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌時間可延長達(dá)達(dá)25min30min25min30min。干熱滅菌法干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)行滅菌。進(jìn)行滅菌。煮沸滅菌煮沸滅菌即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)行即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)行滅菌。滅菌。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌2.4 金屬器械的滅菌 火焰滅菌法：即把金屬器械放在火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%95%的酒精中浸一下，的酒精中浸一下，然后放在火焰上

18、燃燒滅菌。然后放在火焰上燃燒滅菌。 這一步驟應(yīng)當(dāng)在無菌操作過程中反復(fù)進(jìn)行。這一步驟應(yīng)當(dāng)在無菌操作過程中反復(fù)進(jìn)行。干熱滅菌法：即將拭凈或烘干的金屬器械用紙包好，干熱滅菌法：即將拭凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，用的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，用1.11.1公斤公斤/ /厘厘米米2 2 （即（即15 15磅磅/ /英寸英寸2 2），），121 12

19、1 的溫度，滅的溫度，滅菌菌20 min20 min30min30min。2.5 2.5 布質(zhì)制品的滅菌 第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌2.6 2.6 無菌操作室的滅菌無菌操作室的滅菌 無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用2%2%的新潔爾敏或的新潔爾敏或70%70%的酒精擦洗，然后用紫外燈的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約照射約20min20min。使用前用使用前用70%70%酒精噴霧，使空間灰塵落下。酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。第三章外植體選擇和滅菌第三章外

20、植體選擇和滅菌2.7 2.7 操作人員在接種時一定要嚴(yán)格操作人員在接種時一定要嚴(yán)格按照無菌操作的程序進(jìn)行按照無菌操作的程序進(jìn)行第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌防止操作帶來的污染A、整個接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動、整個接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動作要迅速作要迅速正正 確確 錯錯 誤誤第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌B、接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求、接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染正正 確確 錯錯 誤誤第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌C、接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口、接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口防止操作帶來的污染正正 確確 錯錯 誤誤第三章外植體選擇和滅菌第三章外植體選擇和滅菌小結(jié)：常用的滅菌方法小結(jié)：常用的滅菌方法物理方法物理方法化學(xué)方法化學(xué)方法干熱滅菌干熱滅菌(烘燒和灼燒烘燒和灼燒)濕熱滅菌濕熱滅菌(常壓或高壓蒸煮常壓或高壓蒸煮)射線處