自學(xué)考試本科生畢業(yè)論文人工復(fù)制小鼠銅離子中毒的病理變化觀察

1、湖 南 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué)高等教育自學(xué)考試本科生畢業(yè)論文人工復(fù)制小鼠銅離子中毒的病理變化觀察學(xué)生姓名：考 籍 號：年級專業(yè)：2009級畜牧獸醫(yī) 指導(dǎo)老師：學(xué) 院：動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院湖南長沙提交日期：2010年3月湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)高等教育自學(xué)考試本科生畢業(yè)論文誠 信 聲 明本人鄭重聲明：所呈交的本科畢業(yè)論文（設(shè)計）是本人在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下，進行研究工作所取得的成果，成果不存在知識產(chǎn)權(quán)爭議。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體在文中均作了明確的說明并表示了謝意。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 畢業(yè)論文（設(shè)計）作者

2、簽名： 年 月 日目 錄摘 要：4關(guān)鍵詞：41 前言42 材料與方法62.1試臉材料62.1.1試驗動物：62.1.2實驗試劑和儀器：62.2實驗方法62.2.1 動物分組：62.2.2 臨床觀察：62.2.3病理組織學(xué)觀察：63 結(jié)果與分析73.1臨床癥狀與大體病理變化73.2病理組織學(xué)變化74 討論105 結(jié)論11參考文獻:11致 謝12人工復(fù)制小鼠銅離子中毒的病理變化觀察作 者：陳青山指導(dǎo)老師：李德亮（湖南省農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128）摘 要：本研究采用硫酸銅灌胃的方式對小鼠銅中毒的臨床表現(xiàn)及組織器官的病理變化進行觀察。試驗根據(jù)灌胃的劑量將實驗小鼠隨機分為 4 組：對照

3、組 (0 mg/kg)、低劑量組 (50mg/kg)、中劑量組 (100mg/kg)，高劑量組 (200mg/kg)，每組 6 只，試驗周期為 2 周。結(jié)果顯示，高劑量組的死亡率高于中劑量和低劑量組。高劑量組器官的病理形態(tài)學(xué)觀察表現(xiàn)為肝脂肪變性和顆粒變性，肝細胞呈現(xiàn)蜂窩狀外觀，低劑量組和中劑量組肝細胞腫大，胞漿內(nèi)充滿紅染的細微顆粒；低劑量組中腎小管出現(xiàn)顆粒變性，腎小管上皮細胞腫脹，使管腔變小或狹窄，間質(zhì)毛細血管擴張，充血。中劑量組腎小管出現(xiàn)明顯顆粒變性，管腔中有許多紅染蛋白質(zhì)物質(zhì)，出現(xiàn)管型。部分腎小管壁細胞結(jié)構(gòu)被破壞。高劑量組腎小管上皮壞死、崩解、脫落于管腔中。結(jié)果表明，銅中毒主要損害肝臟、腎

4、臟等組織器官，最終導(dǎo)致發(fā)病甚至死亡。關(guān)鍵詞：銅中毒；病理變化；小白鼠；1 前言銅元素普遍存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，是所有低等動物和脊椎動物必需的微量元素之一。自 1925 年被首次報道后，銅作為動植物營養(yǎng)必需微量元素的作用逐漸被人們所認識并不斷被研究1。研究表明，在飼料中添加適量的銅，可明顯提高動物的生產(chǎn)性能。銅的這種特殊生物學(xué)作用，在現(xiàn)代畜牧業(yè)中已被廣泛應(yīng)用，并取得了較好的經(jīng)濟效益。近年來，由于飼料中銅的過量添加而導(dǎo)致的動物中毒現(xiàn)象常有時有發(fā)生4。許多銅鹽如硫酸銅、次醋酸銅、碳酸銅、氯化銅、氧化亞銅、硝酸銅、石油酸銅、三氯酚銅等作為沙蟲劑、浸種劑、殺真菌劑、驅(qū)蟲劑、滅螺劑或木材防腐劑2被

5、廣泛的使用也常常給家畜養(yǎng)殖帶來巨大的潛在危險，動物誤食銅鹽后就會發(fā)生銅中毒。此外，一些植物含有吡咯類生物堿的有毒植物 (如三葉草、千里光、和天蕎萊屬植物) 能夠增強銅與肝臟的親和力、使銅在肝臟蓄積而不能正常排出；另一些含有肝毒性生物堿的植物會造成動物肝細胞的損傷，從而使銅在肝臟的代謝出現(xiàn)異常，也能使動物體內(nèi)蓄銅過多而中毒3。雖然動物每日攝入銅的含量沒有達到中毒劑量，但是動物日糧中鉬的含量非常低或日糧中銅/鉬的比值過高 (大于10)，也能造成銅在動物肝臟內(nèi)蓄積，蓄積過量時動物出現(xiàn)銅中毒癥，有報道羔羊在補飼向日葵 (鉬/鋁比值大于10) 后，出現(xiàn)慢性銅中毒癥狀18。銅中毒的發(fā)生，往往會給養(yǎng)殖業(yè)帶來

6、巨大的經(jīng)濟損失。因此，及時掌握動物銅中毒后的臨床表現(xiàn)及其對機體組織器官的病理損害，從而探討發(fā)病機理將會對銅中毒的臨床診斷和基礎(chǔ)研究提供重要的指導(dǎo)意義17。已有的研究表明，各種動物對銅的毒性作用和銅的敏感性存在有較大的差異10。綿羊敏感性最高，反芻動物次之，高于其它動物6；中毒劑量的報道也不經(jīng)相同：羔羊 25-50 mg/kg，綿羊 20-110mg/kg15，奶牛 200-880 mg/kg7，奶牛 200mg/kg8，蛋雞 500mg/kg，豬為 250-400 mg/kg 17；兔 200 mg/kg16；馬 800 mg/kg，大鼠 1000 mg/kg，肉雞300 mg/kg11，鴨

7、300mg/kg9，鵝 100 mg/kg2。動物銅中毒的研究主要集中于中毒劑量，臨床表現(xiàn)，病理變化，血液生化指標以及發(fā)病機理等方面，在蓄積至一定階段后，會突然出現(xiàn)嚴重的溶血，肝腎損傷，并最終死亡14。動物發(fā)生銅中毒時，6-磷酸葡萄糖脫氫酶，谷胱甘肽過氧化物酶活性降低，而丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，乳酸脫氫酶等酶活性升高16。動物的銅中毒習(xí)慣上分為急性中毒和慢性中毒。急性銅中毒主要以明顯的胃腸炎為臨床癥狀，表現(xiàn)為惡心、流涎、腹瀉、劇烈腹痛13。慢性銅中毒主要以溶血癥狀為主要臨床癥狀，據(jù)國內(nèi)報道，王幼名和王長青等做了豬中毒的研究，臨床表現(xiàn)如下性中毒時精神沉郁、食欲廢絕、嘔吐、腹痛、腹

8、瀉，肌肉松弛，排黑色稀糞，胃與十二指腸粘膜見有出血、潰瘍、壞死病變，肝臟腫大呈土黃色5。徐善良和楊云林等做了山羊的銅中毒研究，具體癥狀如下：銅中毒時病理剖檢變化以胃腸粘膜糜爛脫落、潰瘍、出血為特征12。黨曉鵬和齊長明等做了綿羊的研究，具體癥狀如下：心外膜出血，肝臟腫大膽囊擴張，腎臟表面有出血點15。舒港亮，翟國東和朱秀琴做了雞的研究，結(jié)果如下：急性銅中毒最后痙攣而死，中毒臨床癥狀:拉稀，縮頭伏地.食欲廢絕，精神沉郁，腿部肌肉麻痹，呼吸困難，剖檢可見肝臟腫大，呈塊狀土黃色胃粘膜充血，其中十二指腸較嚴重，膽囊腫大 11。本實驗通過研究小鼠銅中毒，了解和觀察銅離子對小鼠心、肝、脾、肺、腎的影響，從而

9、研究銅中毒對機體器官組織的病理損害，探討發(fā)病機理，為臨床診斷和基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。2 材料與方法2.1 試驗材料2.1.1 試驗動物：昆明種小白鼠 (24 只，體重 18g-22g)，購買于湖南吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。飼養(yǎng)室溫度 2327，每天光照 12 h。2.1.2 實驗試劑和儀器：乙醇 (湖南江虹試劑有限公司)、二甲苯 (上海實驗試劑有限公司)、蘇木素 (上海標本模型廠)、伊紅染色素 (上海試劑三廠)、切片石蠟 (上海標本模型廠)、中性樹膠 (上海標本模型廠)、福爾馬林、碳酸鋰飽和液等。motic奧林巴斯顯微攝影系統(tǒng)、yd202型石蠟切片機。2.2實驗方法2.2.1 動物分組室內(nèi)暫

10、養(yǎng)一周后，試驗小鼠被隨機分成四組：對照組、低劑量組 (50mg/kg)，中劑量組 (100mg/kg)、高劑量組 (200mg/kg)。硫酸銅溶液經(jīng)口灌胃小鼠，對照組以等量生理鹽水代替硫酸銅。每天中午進行灌胃，不限飲水，自由采食，共連續(xù)灌胃 15 d。試驗期間，溫度在 2226，光照 12 h。2.2.2 臨床觀察試驗期間每日進行臨床觀察，紀錄臨床癥狀。在試驗進行的第 10 天和11天，高劑量組有 3 只小白鼠死亡，中劑量組在第 14 天有 1 只小白鼠死亡。死亡的小白鼠立即當(dāng)天取其臟器，余下的小白鼠在試驗期滿時采用人工脫頸致死法進行剖殺，并取心、肝、脾、肺、腎進行觀察，之后放入福爾馬林固定液

11、中固定。2.2.3 病理組織學(xué)觀察(1) 取材：取病變與正常組織的交界處的實質(zhì)臟器 (心、肝、脾、肺、腎)。(2) 固定：將所取病料置 10% 的福爾馬林固定液中固定 48 h,在固定 6h小時后，對組織塊進行修塊。將修好的組織塊放于白色的小包埋盒中，按設(shè)定好的程序進行脫水、透明、浸蠟，其具體的程序步驟為水洗80% 酒精 1h90%酒精 1.5h95% 酒精 2h95%酒精 2h100%酒精 1h100%酒精 1.5h100%酒精 1.5h二甲苯 0.5h二甲苯 1h石蠟 2h石蠟 2h。(3) 包埋：將小包埋盒的蓋子去掉，將組織塊從包埋盒中用小鑷子輕輕取出，取出時注意仍將要切的面朝下，平放在

12、已滴滿石蠟的不銹鋼包埋盒的中央位置，這一點非常重要，否則會將要切的面切不完整，放好組織塊后，將白色的小包盒底部鑲嵌在不銹鋼包埋的上方，再在其上滴滿石蠟。隨后將已包埋好的不銹鋼小包埋盒冷卻使其凝固。當(dāng)組織塊已完全與石蠟?zāi)探Y(jié)合在一起時，將不銹鋼包埋盒輕輕從要切的組織塊底部輕輕去掉，將留有組織塊的白色小包埋盒側(cè)面的石蠟輕輕刮去。(4) 切片：將保留在白色小包埋盒的組織塊固定在石蠟切片機上，先行修片，當(dāng)修到完整的組織時，將切片的厚度調(diào)到 5-7m，再行切片，切片時注意用力均勻，進行連續(xù)切片。(5) 展片、攤片與烘片：將切好的組織薄片用毛筆刷輕輕挑起，同時用小鑷子輕輕將切好的組織薄片的起始部夾起，放入

13、水浴鍋展片，溫度為 45-50。溫度過高可將切片熔化，過低則切片不宜伸展。切片放入展片槽中時，立即用小鑷子輕輕在其上面將其有皺縮的地方展平，此時將已準備好的載玻片垂直伸入液面下在載玻片的 1/3 處將薄層切片緩緩澇起，切片可自動貼附于載玻片上，將載玻片放在切片架上，再將其放在攤片架上。最后再將切片架移到烘片箱中烘干(烘片箱中的溫度為 76)，一般持續(xù)時間為 40min。(6) 脫蠟、染色與封藏：將放有載玻片的染色架放入二甲苯 中浸泡 10 min 二甲苯 中浸泡 10min (以充分脫蠟)100% 酒精 5min100% 酒精 5 min95% 酒精5 min 85% 酒精5 min80% 酒

14、精 5 min蘇木素染液染色5min水洗（將切片架放入事先準備好的清水中沖洗5 min）1%鹽酸酒精分化（這一步驟相當(dāng)關(guān)鍵，它的主要目的是脫去胞漿的著色，時間過長可使胞核的著色脫去。）放進去后要迅速取出，時間一般掌握在4-6 秒鐘自來水緩緩沖洗15-30 min 伊紅染液染色1-3 分鐘95%酒精3s 100%酒精 3s100% 酒精 3s二甲苯 3s 二甲苯 3s。至此 h.e 染色過程全部結(jié)束，將染色架上的載玻片取出，用干凈的紗布將二甲苯液體蘸去，并在上面滴上中性樹膠，將蓋玻片封好，貼上標簽作好標記后放入切片盒中,觀察各個臟器的病理變化。3 結(jié)果與分析3.1 臨床癥狀與病理變化高劑量組臨床

15、表現(xiàn)食欲廢絕，精神沉郁，縮頭，全身震顫，臥地不起，排黑褐色糞，脾臟體積縮小，重量減輕，色澤變淡，肝呈黃褐色，質(zhì)脆易碎，膽囊膨大充滿藍綠色膽汁，死亡病例還可見腎輕度腫大。中等劑量組表現(xiàn)為食欲廢絕，精神沉郁，脾臟體積縮小，重量減輕，色澤變淡，肝呈黃褐色。低劑量組的無明顯的變化。3.2 病理組織學(xué)變化肝臟：低劑量組和中劑量組肝細胞腫大，胞漿內(nèi)充滿紅染的細微顆粒，中央靜脈、肝竇以及間質(zhì)小血管內(nèi)充滿紅細胞。高劑量組肝臟出現(xiàn)明顯顆粒變性和脂肪變性，肝細胞腫大，胞漿內(nèi)充滿大量紅染的細微顆粒或圓形空泡，細胞呈現(xiàn)蜂窩狀外觀 (圖1)。部分病例可見局灶性壞死，內(nèi)肝細胞索排列紊亂，肝細胞胞漿紅染，細胞核出現(xiàn)固縮和碎

16、裂 (圖2)。中央靜脈內(nèi)紅細胞不清楚，只見紅染絲網(wǎng)狀物質(zhì)充滿血管。圖1 肝細胞呈蜂窩狀圖2 肝細胞核固縮和碎裂心臟：在中劑量組和高劑量組可見心肌纖維腫脹，出現(xiàn)許多紅染的細微顆粒(圖3)。心肌纖維間毛細血管內(nèi)充滿紅細胞。脾臟：在中劑量組和高劑量組可見脾臟白髓區(qū)變小，中央淋巴細胞和邊緣區(qū)淋巴細胞數(shù)量減少，網(wǎng)狀細胞增生，紅髓血竇擴張充血（圖4）。高劑量組部分病例脾臟白髓淋巴細胞出現(xiàn)壞死。圖3 肌纖維腫脹和細微顆粒圖4 紅髓血竇擴張充血肺：在中劑量和高劑量組中小血管和毛細血管明顯擴張，內(nèi)充滿紅細胞 (圖5)。高劑量組中部分肺泡腔內(nèi)有少量紅染漿液，部分肺泡擴張出現(xiàn)肺泡性肺氣腫(圖6)。圖5 小血管和毛細

17、血管明顯擴張，內(nèi)充滿紅細胞圖6 肺泡腔內(nèi)有少量紅染漿液腎臟：低劑量組中腎小管出現(xiàn)顆粒變性，腎小管上皮細胞腫脹，使管腔變小或狹窄（圖7），間質(zhì)毛細血管擴張，充血。中劑量組腎小管出現(xiàn)明顯顆粒變性，管腔中有許多紅染蛋白質(zhì)物質(zhì)，出現(xiàn)管型（圖8）。部分腎小管壁細胞結(jié)構(gòu)被破壞。高劑量組腎小管上皮壞死、崩解、脫落于管腔中。圖7 腎小管出現(xiàn)顆粒變性，上皮細胞腫脹，使管腔變小或狹窄圖8 腎小管出現(xiàn)明顯顆粒變性，管腔中有許多紅染蛋白質(zhì)物質(zhì)4 討論本實驗采用三組不同濃度的銅對小白鼠進行攻毒，分別為低劑量、中劑量和高劑量，時間為半個月。高劑量組小鼠在試驗期間有死亡現(xiàn)象，臨床病理癥狀表現(xiàn)為食欲廢絕，精神沉郁，縮頭，全身

18、震顫，臥地不起，排黑褐色糞，脾臟體積縮小，重量減輕，色澤變淡，肝呈黃褐色，質(zhì)脆易碎，膽囊膨大充滿藍綠色膽汁，死亡病例還可見腎輕度腫大。中等劑量變現(xiàn)為食欲廢絕，精神沉郁，脾臟體積縮小，重量減輕，色澤變淡，肝呈黃褐色，低劑量眼觀無明顯變化。本實驗所獲結(jié)果為動物銅中毒的系統(tǒng)研究提供了動物模型，也可供臨床或發(fā)病現(xiàn)場診斷和治療銅中毒做參考，從小白鼠發(fā)病時間、病程經(jīng)過、死亡情況的綜合分析，作者認為銅中毒低劑量和中劑量的引起慢性銅中毒。銅中毒高劑量引起小白鼠的急性銅中毒，表明銅的中毒病理表現(xiàn)因動物種類和銅中毒劑量各異。病理形態(tài)學(xué)的研究表明，小白鼠銅中毒病變靶器官是肝臟、腎臟、消化道和免疫器官，與銅鹽的刺激和

19、腐蝕作用，銅在體內(nèi)組織分布及蓄積特點和銅排出密切相關(guān)。由于銅鹽具有強烈的刺激和腐蝕作用，銅鹽進入消化道便引起劇烈反應(yīng)和造成嚴重的病理損害，表現(xiàn)為肌胃角質(zhì)層增厚、龜裂乃至呈絨毛狀，腸黏膜上皮變性壞死，腸絨毛斷裂，這是銅鹽直接作用于胃腸道黏膜的結(jié)果，導(dǎo)致胃腸功能受損，銅被吸收進入體內(nèi)后主要在肝臟蓄積，隨著時間的增長銅的蓄積量大幅度增加。銅的蓄積一旦超過肝臟對其的利用，在釋放入血之前便對肝細胞造成直接的損害作用，引起肝細胞腫大，顆粒變性和脂肪變性，肝細胞腫大，胞漿內(nèi)充滿大量紅染的細微顆粒或圓形空泡,細胞呈現(xiàn)蜂窩狀外觀。至于臟臟中蓄積的銅大量釋放入血引起血銅升高時，肝銅含量仍未降低，且表現(xiàn)出極強的時間

20、-劑量效應(yīng)，故肝銅可作為評價銅狀態(tài)的一個敏感指標。肝銅蓄積到一定程度時則大量釋放入血引起血銅升高，同時。腎銅濃度也隨之升高，造成腎小管上皮細胞的損傷，導(dǎo)致腎功能受損。5 結(jié)論本研究結(jié)合當(dāng)前銅中毒的研究進展，從病原學(xué)、臨床癥狀以及中毒后對機體各臟器的結(jié)構(gòu)的影響等多角度詳細的闡述了人工復(fù)制銅中毒的病理形態(tài)學(xué)，為人工復(fù)制銅中毒的預(yù)防及診斷提供了極其重要的技術(shù)依據(jù)。發(fā)生銅中毒時，造成了廣泛性實質(zhì)臟器的損傷和出血，尤其是肝臟、腸道和腎臟的病理性損傷更明顯，肝臟：低劑量組和中劑量組肝細胞腫大，胞漿內(nèi)充滿紅染的細微顆粒，中央靜脈、肝竇以及間質(zhì)小血管內(nèi)充滿紅細胞。高劑量組肝臟出現(xiàn)明顯顆粒變性和脂肪變性，肝細胞

21、腫大，胞漿內(nèi)充滿大量紅染的細微顆?；驁A形空泡,細胞呈現(xiàn)蜂窩狀外觀，部分病例可見局灶性壞死，內(nèi)肝細胞索排列紊亂，肝細胞胞漿紅染，細胞核出現(xiàn)固縮和碎裂，中央靜脈內(nèi)紅細胞不清楚，只見紅染絲網(wǎng)狀物質(zhì)充滿血管。腎臟：腎臟：低劑量組中腎小管出現(xiàn)顆粒變性，腎小管上皮細胞腫脹，使管腔變小或狹窄，間質(zhì)毛細血管擴張，充血。中劑量組腎小管出現(xiàn)明顯顆粒變性，管腔中有許多紅染蛋白質(zhì)物質(zhì)，出現(xiàn)管型。部分腎小管壁細胞結(jié)構(gòu)被破壞。高劑量組腎小管上皮壞死、崩解、脫落于管腔中。因此在銅離子作為飼料的添加劑，要確定好銅的含量。參考文獻:1 王長青，李靖愛.宋茜.育成豬微量元素銅中毒的診治j.當(dāng)代畜牧，2003，4(3):31-33

22、.2 王宗元.動物營養(yǎng)代謝病和中毒病學(xué)j.北京.中國農(nóng)業(yè)出版社. 1997，2（1）:5-8.3 王幼明，王小龍.高鋼的應(yīng)用對畜禽的慢性中毒作用及對環(huán)境生態(tài)的影響j.中國獸醫(yī)雜志. 2005，37(6): 36-38.4 劉璐.飲食銅的供給、狀態(tài)及吸收p.國外醫(yī)學(xué)一地理分冊. 1997，18(l):15-20.5 朱秀琴，張德壽.雞銅中毒的臨床病理學(xué)研究j.中國獸醫(yī)科技. 2005，25(12):11-16.6 劉成文，張懷禮，魏登山.豬銅中毒的診斷j.中國獸醫(yī)雜志. 2001，37(3):53-54.7 姚遠峰.豬謐用飼料添加劑引起銅中毒j.廣西畜牧獸醫(yī).1997.13(3):5963.8 李建喜,王學(xué)智,楊志強. 鉬和銅對小鼠抗氧化機能的影響j. 中國獸醫(yī)科技,2004,22(11)：11-15.9 崔恒敏,陳懷濤.雛鴨銅中毒的實驗觀察j.中國家禽,2003,25(11):8-10.11 舒港亮.胡才喜.肉