RT-PCR試驗步驟及注意事項

1、RTPC麒 驗步驟及注意事項RT-PCR實驗時間:2013-01-05 22:32 來源: www.B 作者: 生物界RT-PCR實驗有三步：抽提 RNA， RT，PCR。要求：1. 做 RT前必需測 RNA濃度，逆轉錄體系對 RNA量還是有一些要求，常用 500ng 或 1ug。2. RT 按要求做，一般不會出太大問題。3. PCR，按常規(guī)。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變 Mg2+濃度、退火溫度能解決的。1）RT和 PCR時的引物設計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須在 RT 時，引物設計有 3 種方法即 a：Random9 mers；b：Oli

2、go dT-Adaptor Primer ； 和 c：特異的下游引物。如果用 a和 b方法，是擴增的所有的 cDNA（理論上）， 還要用此產(chǎn)物做 PCR 的模板繼續(xù)擴增。如果用 c 方法，那么要去那里查它的序列呢？ 問題：在做 RT-PCR遇到一怪現(xiàn)象，即對同一動物不同組織擴增同一段基因，結果從一 種組織中可以擴出我的目的基因，條帶非常的好，而另一組織在同樣的條件下 卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結果，百思不 得其解?。ㄗⅲ阂芽隙ㄔ摶蛟趦煞N組織中都表達，且內(nèi)參照在兩種組織都可擴 增出來）從這兩種組織中提取的 RN

3、A的量是不一樣的，我測過吸光度，差異還很大，會 不會和這有關呢？ 請高手指教！解答：1. RT-PCR有兩種做法：條件具備的話可用 kit 進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再 PCR。但后來發(fā)現(xiàn)兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現(xiàn)象，我 推測是體系更加單一比較利于 PCR的進行，當然也可能是我買的 kit 不太好。 （ promega）。2. RT-PCR應具備的條件高質量的 RNA（保留后可做 5， 3RACE）；引物的（最好產(chǎn)物短點） ；若涉及 粗略定量的話還應考慮 RNA的濃度或是 cDNA的濃度（如果由內(nèi)標分子更好，但 我發(fā)現(xiàn)其實很不容易將 RNA的濃度以及內(nèi)

4、標分子的表達量調整的完全一樣） ；體 系的均一性等。3. RACE我做過 RACE（3RACE是寶生物的 Kit ；5RACE是 Gibico ），但現(xiàn)在再進行另 一個同源基因的 3RACE時卻怎么也 P 不出來，這兩個基因是由同一對引物擴 增出來的， 其中一個已經(jīng)獲得了全序列 （RACE的方法），而另一個基因的 3UTR 卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的 3UTR太長的緣故，我都快綠了， 有無RT-PCR的常用內(nèi)標 b actin 和 GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細胞， 不同的刺激。有關內(nèi)參：RT-PCR內(nèi)參照可以在一個管子里做（那樣也是圖好看一些） ，最好分開兩管，把 除了

5、引物之外的 mixture 統(tǒng)一配，拍照后，算目的基因和內(nèi)參的比值，這就是 基因表達的相對濃度。問：我曾經(jīng)作過同一管的 PCR，內(nèi)有 actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條 均一條帶但圖片質量不理想（而且酶量、 Mg2+加倍）。請教 mxbdna2003 ，你是 如何處理同一管的 PCR的各成分的濃度？ 答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template（f

6、or RT and PCR） and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using accurate piptte is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做 RT，其實沒有什么問題，不需要 taq 魅加量， taq 酶本來就是過 量的 - ，（平時做 pcr 的時候，完全可以再省一些 taq 酶

7、的，半斤八兩就可以 了，我想這肯定再很多貼子里應該都談到了。 Mg 就跟不能變了，一變整個體系 就變了。能看到均一條帶就很好了。關鍵是摸，十八摸（太少，只爭朝夕，開個玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然后再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較 的不同的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進行，因為還有互相競爭抑 制的問題，即使不同基因之間。有關內(nèi)參的建議： 一定要做內(nèi)參的，每一次，我想。不作內(nèi)參的結果是不可信的 電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，著我在好幾封帖子里 都談了，再說一邊我得觀點， 1、半定量和定量 RT-PCR做的都是基因相對表達 量，不是絕

8、對表達量，除非你能準確知道來自多少細胞，但是細胞還有死的呢。2、以電泳為基礎的半定量 RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的， 但不能作為最終結果的， 3、半定量 RT-PCR應該再兩管中進行，除非內(nèi)參基因 和目的基因表達相同，長度差不多， GC含量相似，或者實在窮的要省 PCR管和 taq 。關于平臺期和線性期的問題，實際上線性期是指數(shù)期，只不過碰巧 2 的冥和 2 的倍數(shù)是相同的?？瓷先ト魏我粋€時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到 酶促動力學的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化 學的東西。我們學醫(yī)的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶 原料和

9、 buffer 之間的關系，這種反應單靠改變其中一種成分沒有用的，酶一直 是過量，再加酶也沒用，引物 ntp 都是這樣。煙鬼正傳，最好選線性期的開始 階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內(nèi)，所以選一個這兩種的契合點。給你 一張圖你就明白了，再開始的時候酸的是切線，這圖我在 * 帖過。 關于引物設計，再可能的情況下，除了常規(guī)要求之外，最好兼顧跨內(nèi)含子（不 過，根據(jù)要求，還可以專門設計隔內(nèi)含子的，這樣還可以用于基因組PCR）、長度小于 500bp600bp 等等。引物當然要設計成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一臺 機器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一個溫度，這樣任何幾個都可以

10、 拿來披，也不用查。我反復說過了，別用軟件，就用眼睛看，軟件涉及的在好，有些基因在它出軟 件的時候，還沒發(fā)現(xiàn)呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎么考慮內(nèi)含子 的問題呢？18s的引物也和著名的 actin 一樣是設計的， 只要拿到序列就可以了， 但是限 制是只能用總 RNA為模板，但是比 actin 和 bubulin 等可準多了，更不要說 GAPDH 這個破爛了。 18s 除了在細胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠遠高于看 家基因， 所以定量更加準確， 我想， 不知對不對， 請幾位主任和 eeflying 指教。 我認為，就像你用某一種東西的數(shù)量去概括，因該選那種多的東西，說一座房 子是

11、由 2000 塊磚造成的，比說又 29 根梁更準確吧。更不要說沒有看家基因不 看家的缺點，因為他是服務于整個基因組表達譜什么的。PE 有專門的用于實時 PCR的內(nèi)參試劑盒，就是用 18s，不過我們看懂使用的那 條序列，不知有沒有人用過，告知其序列和 genbank 號。 正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因為手上的 actin 的 熒光探針還沒有完，當初和成了一堆。有那位高手用過 18s 的內(nèi)參，請問您的序列（我指的是模板的序列）？ 原位雜交最好用 RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣 roche 的盒子，而且 量也能保證，因為轉錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也

12、容易 理清。我覺得做 RT-PCR的方法和條件及應注意的事項就是那么幾條 , 許多專業(yè)書都有 詳細的描述 , 但是許多人還是歷經(jīng)多次磨難，有時就是得不出結果。因此，我認 為因為每個人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有 他自己的特殊性 ,我的以下經(jīng)歷說明：做實驗時各人的情況不同 , 做不出時還是 要好好動一下腦子。記得我開始我的 PCR時，按常規(guī)方法，提取總后，首先用 自己設計的下游引物進行逆轉錄，不斷改變反應條件，進行了次均沒有結果。 后來考慮到本人的克隆的 PCR的片斷位于我們實驗另一位同學克隆的片斷當中， 而該同學已經(jīng)用 RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些產(chǎn)物做

13、模 版再進行時也沒辦法重復出她的產(chǎn)物） ，因此，我先用她的引物和條件擴 增出她的片斷，然后用她的產(chǎn)物作模板（有點改進，逆轉錄反應 換用了 mers 隨機引物），用我的引進物進行一般 PCR，終于得到我的產(chǎn)物，測 序結果完全正確。盡管我的這個經(jīng)歷別人很人遇到，但足可以說明實驗可以有 自己的模式，書本的知識和別人的經(jīng)驗很重要，但有時也不定要受到書本框框 和別人經(jīng)驗的限制請問：1 引物的特異退火溫度怎樣設定？可以根據(jù) gc 和 at 含量算出嗎？可以用引物 報告單上的 Tm值嗎？2 PCR時 20 微升體系中 cDNA應加多少比較合適？ MgCl2 應加多少？各個成分的 量有無確定標準？3 PCR

14、結果跑電泳， actin 有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與 cDNA的量 少有關嗎？ Mg離子太多是否會抑制 Taqase 的活性？ 一般來說引物報告單傷得是對的 ,也可以自己算 , 實際上重要的各條引物一致 , 剩下的可以摸的 .20 中是指體積還是量 ?只要不明顯改變體系的離子強度 , 加 1,2ul 都可以的 .mg 要調的, 但我總覺得沒有書里講的那么玄乎 ,我都是常年不變的 .如果內(nèi)參照有，目的沒有，至少證明不是美麗惹的禍原因書里應該都說了. 在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原 因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，

15、一般反應不需 要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分 析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結 果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑 制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它 分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器 械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和 細胞中則含有人量內(nèi)源性的RNA酶。

16、一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180C的高溫下干烤6hr或更長時間。2. 塑料器皿可用0. 1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意：有機玻璃器具因可被 氯仿腐蝕，故不能使用)。3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡 在3% H202室溫lOmin,然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC,在37C處理12hr以上。然后用高壓 滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水 配制，然后經(jīng)0.2211m濾膜過濾除菌。5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過

17、程中手套要勤換。6. 設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。二、常用的RNA酶抑制劑1. 焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA 酶的活性基團組氨酸的咪哇環(huán)結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。2. 異硫鼠酸??；目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也 使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶 有強烈的變性作用。3. 氧帆核糖核昔復合物：由氧化銳離子和核昔形成的復合物，它和RNA酶結合 形成過渡態(tài)類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin)：從大鼠肝或人胎盤中提取得來

18、的酸性糖蛋白。 RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分離與純化真核細胞的編A分子最顯著的結構特征是具有5,端帽子結構57G)和3,端 的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細胞mRNA的3端存在20-30個腺昔酸 組成的Poly (A)尾，通常用Poly (A+)表示。這種結構為真核mRNA的提取， 提供了極為方便的選擇性標志，寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親合層析 分離純化mRNA的理論基礎就在于此。mRNA的分離方法較多，其中以寡聚(dT)-纖維素柱層析法最為有效，已成

19、為常 規(guī)方法。此法利用mRNA 3,末端含有Poly (A+)的特點，在RNA流經(jīng)寡聚(dT) 纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低 鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餡水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚(dT) 纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA一、試劑準備1. 3M 醋酸鈉(pH 5.2)2. 0. IM NaOH3. 1X樣緩沖液：20mM Tris-HCl (pH 7. 6)； 0. 5M NaCl； IM EDTA (pH 8.0)； 0. 1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl (pH 7.

20、6)、NaCl、EDTA (pH &0)的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至 65C時，加入經(jīng)65C溫育(30min)的10%SLS至終濃度為0.1%。4. 洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl (pH 7. 6)； lmM EDTA(pH 8. 0)； 0. 05% SDS5. 無水乙醇、70%乙醇6. DEPC二、操作步驟1. 將0. 5-1. Og寡聚(dT)-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。2. 用DEPC處理的lml注射器或適當?shù)奈?，將寡?dT)-纖維素裝柱0. 5-lml, 用3倍柱床體積的DEPC H20洗柱。3. 使用IX上樣緩沖液洗柱，直

21、至洗出液pH值小于&0。4. 將RNA溶解于DEPC H20中，在65C中溫育lOmin左右，冷卻至室溫后加入 等體2X上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱 床后，再用IX上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。5. 將所有流出液于65C加熱5min,冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6. 用510倍柱床體積的IX上樣緩沖液洗柱，每管lml分部收集，0D260測定 RNA含量。前部分收集管中流出液的0D260值很高，其內(nèi)含物為無Poly(A)尾的 RNAo后部分收集管中流出液的0D260值很低或無吸收。7. 用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly (A+) RNA,分部收

22、集，每部分為1/3-1/2 柱體積。8. 0D260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體 積3M NaAc (pH5.2)、25倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20C放置30mino9. 49離心,10000gX15iniri,小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。注意：此 時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到。4C離心，10000gX5min,棄上清，室溫 晾干。10. 用適量的DEPC H20溶解RNA。三、注意事項1. 整個實驗過程必須防止Rnase的污染。2. 步驟(4)中將RNA溶液置65C中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個, 一個

23、是破壞RNA的二級結構,尤其是mRNA Poly (A+)尾處的二級結構，使Poly (A+) 尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一個目的是能解離mRNA與rRNA 的結合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。3. 十二烷基肌氨酸鈉鹽在18C以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫 低于18C最好用LiCl替代NaCl。4. 寡聚(dT) -纖維素柱可在4C貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、 滅菌ddH20、上樣緩沖液洗柱。5. 一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細胞能提取1-5 ug Poly (A+)RNA,約相當于上 柱總RNA量的1%-2%oRNA

24、酶保護試驗 （RNase Protection Assay,RPA）是通過液相雜交的方式 , 用反義 RNA探針與樣品雜交，以檢測 RNA表達的技術。與 Northern 雜交和 RT-PCR比較， RPA有以下幾個優(yōu)點：1 檢測靈敏度比 Northern 雜交高。由于 Northern 雜交步驟中轉膜和洗膜都 將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而 RPA 將所有雜交體系進行電泳， 故損失小，提高了靈敏度。2 由于 PCR擴增過程中效率不均一和反應“平臺”問題，基于PCR產(chǎn)物量進行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而 RPA 沒有擴增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真 實性較高。3 由于與反義 RNA探針

25、雜交的樣品 RNA僅為該 RNA分子的部分片段，因此， 部分降解的 RNA樣品仍可進行分析。4 步驟較少，耗時短。與 Northern 雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。5 RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。6 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。一、試劑準備1 GACU POO：L取 100mM AT、P CTP、GTP各 2.78 l 、100mM UTP 0.06l ，加 DEPC H2O至 100 l 。2. 雜交緩沖液 IPES 0.134g 、0.5M EDTA（pH

26、8.0）20l 、5M NaCl 0.8ml 、甲 酰胺 8ml，加 DEPC H2O至 10ml。3. RNase 消化液： 5M NaCl 120l 、1M Tris-HCl（pH7.4） 20 l 、0.5M EDTA （pH8.0）20l 、RNase A（10mg/ml） 8l 、RNase T1（250U/ l） 1l ，加 DEPC H2O至 2ml 二、操作步驟1反義 RNA可由含 T7 或 SP6啟動子的重組質粒為模板制備，也可以用含啟動 子的 PCR產(chǎn)物為模板制備，本文介紹后者。（1）設計含 T7 啟動子的 PCR引物由于 PCR產(chǎn)物將作為合成反義 RNA的模板，所以一對引

27、物中的下游引物 5 -端 要含 T7啟動子序列 :T7啟動子序列為： 5 -TAATACGACTCACTATAGGG 引物設計的其他要求與一般 PCR引物的設計相同。 PCR產(chǎn)物的長度決定了反義 RNA探針的長度，具體設計時可考慮 100-400bp 長。最好采用巢式 PCR，即先擴 增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異 性，如下圖所示：上游引物下游引物 T7 啟動子序列下游引物（2）PCR先用上游引物和下游引物進行 PCR，再以 PCR 產(chǎn)物為模板 , 用上游引物和下游 引物 -T7 進行二次 PCR（具體操作參見 PCR章節(jié) ） 。（3）探針合成標記與純化在

28、 0.5ml 離心管中加入下列試劑：RNasin （40U/l ） 0.5 lGACU POOL GAC（含 GTP、 CTP、ATP各 2.75 mM,UTP 61M） 2l -32PUTP（10Ci/ l） 2.5 lDTT （二硫蘇糖醇， 0.1M） 1 l5轉錄 buffer 2 l 模板（ 50ng/ l ） 1l T7 RNA 聚合酶 （15U） 1 l 混合后，短暫離心， 37OC保溫 1hr 。加入 DNase（10U/l ）1l, 37OC 15min, 然后 75 OC 10min 以滅活 DNAse 和 T7 RNA 聚合酶。加入：飽和酚 50 l氯仿 50 l酵母 tR

29、NA（2g/ l ） 4 lDEPC H2O 100 l 室溫下充分混勻，離心 10000g2min。取上層液置另一 0.5 ml 離心管中，加入 100 l 氯仿，混勻，離心 10000g2min。將上層液轉移至另一 0.5ml 離心管中， 再加入 3MN aAc 10l 、預冷無水乙醇 250l ，混勻后， -20OC靜置 30min。4OC 離心 13500g10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇 100l 洗滌， 4OC 離心13500g2min, 棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入 50l 雜交緩沖液溶解 沉淀，4OC下保存待用?？捎媚蛩?- 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。 （參見

30、本 節(jié)電泳步驟）。2雜交（1）RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為 1g/l 。（2）取 8l RNA加入 1-3 l 探針（根據(jù)探針檢測結果調整）于 0.5ml 離心管 中。（ 2） 80OC保溫 2min，然后 40-45OC下雜交 12-18hr 。3. 消化（1）雜交管于 37 OC保溫 15min，加入 RNase消化液， 37 OC保溫 30min。（2）加入 10%SDS1 0l、10g/l 蛋白酶 K 20l ，混勻，37 OC保溫 10min。（3）加入 65 l 飽和酚和 65 l 氯仿，混勻，室溫離心， 10000g2min。（4）轉移上層液到另一 0.5 離心管中，加

31、入 10l 酵母 tRNA和 3M NaAc 15l ， 再加入 200l 異丙醇，混勻后，置-20OC 30min，4 OC離心 ,135000g 10min。（5）棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入 5-8 l 上樣緩沖液溶解沉淀。4、電泳與放射自顯影（ 1）配制凝膠： （50ml）40%丙烯酰胺 -亞甲雙丙烯酰胺（ 19：1） 6.25ml5TBE 10ml尿素 24g 加 H2O至 50ml 溶解后加入 25%過硫酸胺 50l ，TEMED 50 l ，混勻，注入電泳槽中，插入梳， 待膠凝固。（2）預電泳以 1 TBE為上下槽電泳緩沖液， 加上電壓后進行預電泳， 如果用測序電泳裝置， 電壓

32、應達 2000v 以上，功率設定為 100w，溫度設為 50 OC。待膠板溫度達 50 OC 時，暫停電泳，準備加樣。（3）加樣將已溶解在加樣緩沖液中的樣品 80 OC 加熱 2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr 。（電泳條件同預電泳） 。（ 3） 電泳結束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒 中，暗室紅光下，壓上一張 X 片，蓋上暗盒， -70OC曝光 1-3 天。暴光結束后， 將 X 光片顯影、定影、水洗、晾干。三、注意事項1本實驗大部分為 RNA操作，注意 RNA酶的污染。2RNase消化液消化未雜交的單鏈 RNA和探針 RNA，當探針與樣品之間有堿基 錯配時，錯

33、配位點也將被消化，因此會產(chǎn)生片段較小的雜交片段。因此進行 PCR 時，采取盡量減少錯配的措施。3、 同位素對 RNA合成有一定影響，有時會產(chǎn)生非全長的探針。因此，標記時 間不宜過長。4、RNase 消化液有時會產(chǎn)生過度消化而無檢測信號， 可以將消化液稀釋 10-100 倍后使用?？赡軉栴}出在標本的保存：一般四小時之內(nèi)就應處理，分離出細胞說的是套式 PCR,可以在你的第一次 PCR兩個引物內(nèi) , 再設計一對引物進行第二次 PCR就行了如果你的第一次 PCR剛好包括目的片段 , 那只好設計個更長的了 第二次的引物設計要求可以低一點以 50 l 體系為例引物各 1 l第一次 PCR產(chǎn)物 5l二次 P

34、CR和巢式 PCR，即設計兩對引物進行擴增，不是一個概念，它是拿第一次的 PCR產(chǎn)物，稀釋 100-1000 倍做模板，加入底物，從新進行擴增反應，以期增 加產(chǎn)物的量我做 RT-PCR時, 提總 RNA時,都是用滅菌 DEPC水,按 1:100 稀釋后測 OD260和 OD280,后根據(jù)公式 :RNA濃度=OD260*稀釋度/25（ug/ul）, 后用 1mg total RNA 分 離 mRNA做. 逆轉錄及 PCR,效果很好 .luoyu10 wrote: 各位大哥： 我有一個問題請教， RT-PCR要求模板 RNA的 260nm/280nm的比值最低為多少， 如果太低是不是會影響結果？最

35、低到 1.8 ，最好 2.0 ，我感覺稍微低一點影響不算太大。 問：我是的新手，想請教引物如何設計？ 好的引物所具有的令人滿意的特點：* 典型的引物 18到 24 個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降 低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于 24 核苷的引物并不意味 著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而 且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。*選擇 GC含量為 40 到 60或 GC含量反映模板 GC含量的引物。*設計 5端和中間區(qū)為 G或 C 的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。*避免引物對 3末端存在互補序列，這會形成引

36、物二聚體，抑制擴增。*避免 3末端富含 GC。設計引物時保證在最后 5個核苷中含有 3個 A或 T。* 避免 3末端的錯誤配對。 3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延 伸。* 避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。 目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物 5端而不影響特異性。當計算引物 Tm 值時并不包括這些序列，但是應該對其 進行互補性和內(nèi)部二級結構的檢測。有時候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序 列，可以設計簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能 性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以

37、參考密碼子使用表，根據(jù)不同 生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引 物的退火溫度。不要在引物的 3端使用簡并堿基，因為 3端最后 3 個堿基的 退火足以在錯誤位點起始 PCR。使用較高的引物濃度（ 1M到 3M），因為許多 簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。【經(jīng)驗】如何確認 RNA的質量 各位都知道，提取到質量良好的 RNA（包括總 RNA和 mRN，A 以下同）是非常困 難，關于 RNA的提取技術，我就不說了，為什么呢？或許各位非常關心呢，我 是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的， 內(nèi)容當然都是一樣的了，所以實驗做的好不好，主要是心的投入多少的問題， 所以