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文檔簡(jiǎn)介

1、n(一)滅活:殺死病原微生物,但不影響免疫原性;其次是破壞血清的補(bǔ)體,以免干擾血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果。n 滅活劑:滅活微生物的化學(xué)試劑。n滅活方法:物理滅活:加熱、超聲波及射線滅活微生物,此方法免疫原性易破壞,現(xiàn)很少使用(血清56C半小時(shí)滅活補(bǔ)體用此方法)。n 化學(xué)滅活:用化學(xué)試劑將病原微生物殺死,此方法經(jīng)常使用。二、常用的滅活劑種類和原理二、常用的滅活劑種類和原理n(一)甲醛:是最古老常用的滅活劑,現(xiàn)在我國(guó)用的26種滅活疫苗,均以甲醛為滅活劑。n 性質(zhì):甲醛為刺鼻的氣體,水溶液叫福爾馬林,濃度為36%-40%。10C以下易聚合成三聚甲醛或多聚甲醛,為白色沉淀。n 原理:甲醛的醛基起滅活作用,可使n

2、蛋白質(zhì)的氨基羥甲基胺n 羧基亞甲基二醇單酯n 羥基羥甲基酚n 巰基硫代亞甲基二醇n濃度:需氧菌甲醛濃度到0、1%-0、2%.n 厭氧菌0、4%-0、8%.n 病毒0、05%-0、4%.n 原則是濃度低,時(shí)間短,溫度低可以滅活細(xì)菌,盡量減少破壞抗原(通常加入量,以甲醛含量量計(jì)算,折合福爾馬林濃度)。n(二)烷化劑:將烷基引入,形成烷基取代物,使微生物變性死亡。n原理:主要破壞病毒的核酸,作用于A:G堿基,引起DNA單鏈斷裂或雙鏈鉸連。n此類常用于病毒滅活,種類有AEIN-乙酰乙烯亞胺,加入濃度到0、05%。nBEI二乙烯亞胺,濃度0、02%;EEI2乙基乙烯亞胺,GDA縮水甘油醛。n 滅活后加硫

3、代硫酸鈉可終止滅活,防止抗原損失。n 保存:AEI,0-4C一年,-20C二年;BEI 0-4C保存一個(gè)月。n(三)苯酚(石碳酸)人類用的 第一個(gè)消毒藥,具有特殊氣味的無色結(jié)晶,易潮解成水溶液,與光、氧后顏色變紫色。n原理:蛋白質(zhì)變性以及抑制氧化脫氫酶,芽孢和病毒對(duì)它抵抗力強(qiáng)。n滅活濃度:抑菌作用是0、20、5%(血清防腐),殺菌是1%,殺葡萄球菌是3%。n消毒常用它的衍生物,來蘇兒(甲酚皂)35%濃度,特殊氣味,覆蓋其他氣味,也是醫(yī)院常用的。(Joseph Lister,18271912)首創(chuàng)用石炭酸噴灑手術(shù)室和煮沸手術(shù)用具以防術(shù)后感染,為防腐、消毒,以及無菌操作奠定了基礎(chǔ)。n(四)結(jié)晶紫(

4、龍膽紫),也叫紫藥水,堿性染料,也叫甲紫或甲基青蓮,化學(xué)名,六甲基副玫瑰苯胺。n原理:堿性陽離子可結(jié)合細(xì)菌陰離子羧基;干擾細(xì)胞壁粘肽合成;常作用于革蘭氏陽性菌。n生物制品的應(yīng)用有豬瘟結(jié)晶紫疫苗,雞白痢染色抗原。n(五)丙酰內(nèi)酯 良好病毒滅活劑,性狀是無色有氣味液體,易潮解和高溫失效,5C密封保存好,現(xiàn)主要用于狂犬滅活苗。n另還有防治細(xì)菌霉菌生長(zhǎng)的防腐劑:硫柳汞(乙基汞硫代水楊酸鈉),疊氮鈉(NaN3)n它們使用濃度0、01-0、02%??煞乐寡甯瘮?。三、影響滅活作用的因素三、影響滅活作用的因素n(一)藥物的特異性:酚類不能殺滅真菌和病毒,陽離子的結(jié)晶紫,主要作用于G+菌。n(二)微生物的種類

5、和特異性:G+菌和G-菌對(duì)藥物敏感不一樣,繁殖體和芽孢對(duì)藥物敏感也不一樣。n(三)藥物濃度:濃度愈大,滅活越快,抗原也損失大;但是,95%酒精沒75%酒精殺滅細(xì)菌好。n(四)溫度:溫度與滅活成正比,每升高10度,金屬類殺菌作用增加25倍。但高溫超過40C,抗原也損失大。n(五)時(shí)間:滅活時(shí)間與溫度和濃度成反比,即滅活殺菌 長(zhǎng),溫度舊低,濃度也 低,就可以殺滅細(xì)菌。n(六)pH:堿性快,酸性慢,酸性環(huán)境對(duì) 抗原保護(hù)好。n(七)有機(jī)物存在:環(huán)境的 有機(jī)物減低滅活的效果,微生物也是有機(jī)物。四、滅活疫苗時(shí)的注意事項(xiàng)1.2人參加滅活,注意藥品名和量,滅活后標(biāo)記。2.37C滅活一天后,接種適宜培養(yǎng)基無菌檢

6、查。3.動(dòng)物試驗(yàn),滅活苗制成后,注射小白鼠0、2ml,兩只,觀察3天。4.使用試驗(yàn):用戶可先注射1-2頭,觀察12天,看有無過敏,應(yīng)激等反應(yīng),證明安全,才全群使用。n思考題:思考題:1.什么叫滅活和滅火劑?什么叫滅活和滅火劑?2.滅活劑的種類有哪些?滅活劑的種類有哪些?3.影響滅活的因素是什么?影響滅活的因素是什么?4.滅活的注意事項(xiàng)有哪些?滅活的注意事項(xiàng)有哪些?第二節(jié)第二節(jié) 保護(hù)劑保護(hù)劑n保護(hù)劑也叫穩(wěn)定劑,是防止微生物在凍干過程中受到破壞。n按作用原理分兩類:n滲透劑:能滲入細(xì)胞,使胞內(nèi)外滲透壓平衡,防止慢凍時(shí)損傷細(xì)胞。有甘油,蔗糖,二甲基亞砜。n非滲透劑:防止細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換在速凍時(shí)保護(hù)細(xì)

7、胞。有 蛋白質(zhì),聚乙烯吡咯酮。n按保護(hù)劑分子量分類:n低分子量保護(hù)劑:糖、氨基酸類。n高分子量保護(hù)劑:脫脂牛奶、明膠。n按化學(xué)性質(zhì)分類:n復(fù)合物:脫脂牛奶,血清。n糖類:蔗糖、乳糖。n鹽類:乳酸鈣、谷氨酸鈉。n醇類:甘油,山梨醇,甘露醇。n酸類:檸檬酸,氨基酸。n聚合物:葡聚糖,聚乙烯吡咯酮。一、凍干保護(hù)劑的組成和作用一、凍干保護(hù)劑的組成和作用n按組成將保護(hù)劑分為營(yíng)養(yǎng)液,賦形劑,抗氧化劑。n營(yíng)養(yǎng)液:使受損細(xì)胞修復(fù):脫脂牛奶,蛋白質(zhì),氨基酸,糖類。n賦形劑:骨架作用,制品形成網(wǎng)孔結(jié)構(gòu),易溶解-蔗糖,乳糖。n抗氧化劑:保護(hù)酶類,防止氧化VC,VE,硫代硫酸鈉。保護(hù)劑的作用:1.防止細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶和細(xì)

8、胞失去水分。2.平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓,防止細(xì)胞破裂。3.助于細(xì)胞修復(fù)以及凍干后復(fù)蘇。二、影響保護(hù)劑效果的因素二、影響保護(hù)劑效果的因素 判斷保護(hù)劑的好壞,從凍干后的存活率,以及生物制品的保質(zhì)期研究。然后對(duì)不同物質(zhì)篩選不同配方,選出好的保護(hù)劑。n 1、保護(hù)劑的種類:不同微生物用不同的保護(hù)劑。n 2、保護(hù)劑的濃度:510%的葡萄糖保存大腸桿菌存活率高。n 3、保護(hù)劑配制方法:糖、血清、維生素不能高溫滅菌,糖可以114C30分鐘滅菌,其他可以過濾除菌。n 4、保護(hù)劑的pH:一般為6-8。三、常用的保護(hù)劑三、常用的保護(hù)劑n生物制品保護(hù)劑很多,各國(guó)家不同,如雞新城疫苗(ND),我國(guó)是5%蔗糖脫脂牛奶;日本是

9、5%乳糖、0、15%聚乙烯吡咯酮、1%馬血清。n(一)不同微生物用不同保護(hù)劑1.細(xì)菌疫苗:10%蔗糖;5%蔗糖脫脂牛奶;5%蔗糖、1、5%明膠;10-20%脫脂牛奶。2.厭氧菌苗:0、1%谷氨酸鈉、10%乳糖;10%脫脂牛奶;7、5%葡萄糖血清。3.病毒疫苗:多用混合保護(hù)劑,如5%蔗糖脫脂牛奶。q(二)幾種常用的保護(hù)劑1.5%蔗糖脫脂牛奶新城疫疫苗2.明膠蔗糖保護(hù)劑-禽霍亂疫苗3.聚乙烯吡咯酮乳糖厭氧菌4.SPGA(蔗糖76、62g,磷酸二氫鉀0、52g,磷酸氫二鉀1、62g,谷氨酸鈉0、83g,牛血清蛋白10g,去離子水1000ml)雞馬立克氏疫苗。n(三)保護(hù)劑的添加:一般是疫苗和保護(hù)劑1

10、:1加入(5%蔗糖脫脂牛奶新城疫疫苗),還有是按疫苗量加入保護(hù)劑到規(guī)定濃度(如5%蔗糖明膠保護(hù)劑,加疫苗是先配濃度高的40%的蔗糖、12%明膠,然后按疫苗7份,保護(hù)劑1份混合。)。n弱毒疫苗飲水:加0、2%奶粉,以中和水中的 有害離子和毒性物質(zhì)。n思考題:思考題:n什么叫保護(hù)劑?組成和作用是什么?什么叫保護(hù)劑?組成和作用是什么?n影響保護(hù)劑效果的因素有哪些?影響保護(hù)劑效果的因素有哪些?n常用保護(hù)劑有哪些?常用保護(hù)劑有哪些?第三節(jié)第三節(jié) 免疫佐劑免疫佐劑n一、佐劑的概念和原理:一、佐劑的概念和原理:n(一)概念:adjuvant一詞來源于拉丁語,即輔佐之意。免疫佐劑是一種非特異免疫增強(qiáng)劑,先注射

11、或和抗原同時(shí)注射,能明顯增強(qiáng)免疫反應(yīng)。最新概念:凡是增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì),均叫佐劑。n(二)佐劑具備的條件n1、安全無毒副作用。n2、無致癌性。n3、純度高,吸附力強(qiáng),易吸收。n4、不含與動(dòng)物交叉免疫的抗原物質(zhì)。n5、不引起機(jī)體對(duì)自身超敏性。n6、耐儲(chǔ)存,1年以上,不變質(zhì)。n(三)作用機(jī)理:1.抗原遞程助于吞噬細(xì)胞的吞噬和抗原傳遞。引起細(xì)胞浸潤(rùn)。2.抗原尋找增加抗原目標(biāo),改變抗原構(gòu)型,吸引吞噬細(xì)胞;延長(zhǎng)體內(nèi)儲(chǔ)存。3.免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)免疫應(yīng)答,包括細(xì)胞免疫和體液免疫。n佐劑的分類:1.按物理性質(zhì):顆粒型佐劑,非顆粒佐劑。2.按生物學(xué)性質(zhì):微生物和非微生物佐劑。3.按存儲(chǔ)時(shí)間:儲(chǔ)存型和非存儲(chǔ)型

12、。n(一)顆粒型佐劑將抗原包括成顆粒狀。n1、鹽類佐劑氫氧化鋁膠,明礬,磷酸三鈣等。n2、油類佐劑nA、弗氏佐劑:1935年,美籍匈牙利學(xué)者Freund發(fā)明,分弗氏不完全佐劑:礦物油75-85%+加羊毛脂(乳化劑)1525%,充分乳化即成,簡(jiǎn)寫FIA,Freunds incomplete advuant;弗氏完全佐劑:是在FIA中加入死結(jié)核桿菌或卡介苗即成,縮寫FCA.。nB、礦物油司本佐劑(現(xiàn)在經(jīng)常用的,以后專講)n3、免疫刺激復(fù)合物佐劑簡(jiǎn)寫ISCOM佐劑(皂苷類)。n4、蜂膠佐劑n5、脂質(zhì)體佐劑n其它佐劑MF59,微膠囊佐劑。n(二)非顆粒佐劑1.肽類佐劑:胞壁酰二肽(結(jié)核桿菌細(xì)胞壁),脂

13、肽及免疫調(diào)節(jié)多肽。2.表面活性劑:海藻糖合成的衍生物。3.核酸類:合成核苷酸聚合體,次黃嘌呤衍生物,免疫刺激序列DNA。4.含硫復(fù)合物:左旋咪唑(既可驅(qū)蟲,又可免疫增強(qiáng))。5.高分子碳水化合物,香菇多糖。6.細(xì)胞因子:IL1、2、4;干擾素,轉(zhuǎn)移因子等。7.其它,霍亂毒素,類毒素。三、常規(guī)免疫佐劑三、常規(guī)免疫佐劑n(一)鹽類佐劑n 1926年Gleny使用鋁膠佐劑,幾十年來,人畜疫苗已經(jīng)廣泛使用該佐劑。n 作用機(jī)理:a,儲(chǔ)存和延緩吸收;b、增加抗原表面積;c、形成巨噬細(xì)胞肉芽腫(增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫)。n1、氫氧化鋁膠n合成方法:有三種,鋁粉加燒堿;明礬加碳酸鈉以及明礬加氨水等。n明礬加氨水方法

14、:20%澄清的明礬水,溫度60度,邊攪邊加氨水,到pH8時(shí)停止,然后打磨均勻,清水漂洗多次硫酸根離子,到pH7時(shí)既可,裝瓶高壓滅菌,用時(shí)20%加入疫苗。n2、明礬:有鉀明礬和胺明礬,主要是吸附、沉淀、濃縮作用;精致10%明礬水,滅菌,25度保存,按疫苗量12%加入,搖勻即可,有沉淀作用。主要用于破傷風(fēng)類毒素的沉淀和氣腫疽滅活疫苗的使用。n3、磷酸三鈣佐劑,與鋁膠同樣作用,制作簡(jiǎn)便。n將滅菌的20%氯化鈣2、5ml加入100ml疫苗中搖勻,再加入20%磷酸氫二鈉7、5ml,搖勻即成白色絮狀沉淀。加的次序不能錯(cuò),該佐劑沉淀作用比鋁膠強(qiáng)。n(二)油類佐劑(礦物油司本佐劑)n乳化劑是一種降低其它溶液表

15、面張力作用的物質(zhì),可使一種物質(zhì)分散混合于另一不相容的液體中。司本80或吐溫80既是乳化劑。他們可使油類和水劑疫苗乳化均勻。n疫苗水劑是分散相(內(nèi)相),油類為連續(xù)相(外相),兩者中間是乳化劑,可以做成油包水,W/O;也可以做成水包油,O/W;前者不易吸收,儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)。后者容易吸收和釋放。n最常用是白油司本佐劑n方法:制備油相:94%杭州10號(hào)白油,加6%司本80(HLB,親水親油值,值高親水強(qiáng),值低親油強(qiáng)),HLB是4、2,混合后加2%硬質(zhì)酸鋁,熬化溶解,高壓滅菌備用。n 水相:疫苗加4%吐溫80(HLB 15)攪拌均勻即成。按油:水,31:1進(jìn)行高速攪拌或膠體磨磨3遍就成。如果攪拌油中慢慢加入

16、水相,制成是油包水,W/O,反之是水包油,O/W。n油乳疫苗檢驗(yàn):n1、粘度檢測(cè):口徑1、2mm吸管,吸1ml乳劑,放出0、4ml的時(shí)間在26秒為宜,不可多于1015秒,注射困難。n2、穩(wěn)定性檢查:加速老化試驗(yàn),37度,1030天,不破乳;離心3000轉(zhuǎn)/分鐘,15分鐘不分層,可以保存一年。(三)蜂膠佐劑n1、蜂膠的理化特性:蜂膠含樹脂、蜂分泌物,蜂蠟、花粉及其它多種物質(zhì),為固體粘稠狀,冷硬熱軟,灰褐色,20-40度發(fā)粘,15度下變硬脆,60-70度液化。n等級(jí):乙醇溶解后測(cè)含量,含66-70%為一級(jí);61-65%為二級(jí);56-60%三級(jí);50-55%是四級(jí)。方法:2、5克蜂膠,加乙醇25ml

17、冷浸24h,濾紙過濾,45度干燥,計(jì)算浸出物的含量。n2、作用:抗菌抗病毒、抗腫瘤、消炎和免疫增強(qiáng)作用。n3、蜂膠的使用n蜂膠處理:溫度4-8度粉碎,過篩,1:4加入乙醇浸泡24-48h,濾紙過濾去渣,算出含量,4度保存。n蜂膠的加入:一般按疫苗量的到10mg/ml,搖勻成乳濁狀。n山東濱州獸醫(yī)研究所 生產(chǎn)蜂膠系列疫苗。第四節(jié)第四節(jié) 新型免疫佐劑新型免疫佐劑n一、細(xì)胞因子佐劑一、細(xì)胞因子佐劑n(一)細(xì)胞因子的概念和分類(一)細(xì)胞因子的概念和分類n 概念:是細(xì)胞釋放出類似激素作用的生物概念:是細(xì)胞釋放出類似激素作用的生物效應(yīng)物質(zhì),在免疫應(yīng)答中起重要作用。效應(yīng)物質(zhì),在免疫應(yīng)答中起重要作用。n 分類

18、:經(jīng)典細(xì)胞因子:淋巴毒素,腫瘤壞分類:經(jīng)典細(xì)胞因子:淋巴毒素,腫瘤壞死因子,干擾素。死因子,干擾素。n 免疫調(diào)節(jié)因子:白細(xì)胞介素,集落刺免疫調(diào)節(jié)因子:白細(xì)胞介素,集落刺激因子。激因子。n(二)作用特點(diǎn):(二)作用特點(diǎn):n 三多一高一快。三多一高一快。n 多效性多效性非特異免疫調(diào)節(jié)非特異免疫調(diào)節(jié)n 多源性多源性多種細(xì)胞可以產(chǎn)生一種因子多種細(xì)胞可以產(chǎn)生一種因子n 多靶性多靶性作用多個(gè)免疫靶細(xì)胞作用多個(gè)免疫靶細(xì)胞n 高效性高效性類似激素,少量就可以,也叫免類似激素,少量就可以,也叫免疫激素疫激素n 快速性快速性快速反應(yīng),如速發(fā)變態(tài)反應(yīng)??焖俜磻?yīng),如速發(fā)變態(tài)反應(yīng)。n(三)細(xì)胞因子的作用(三)細(xì)胞因子的

19、作用n 1、提高疫苗免疫效果、提高疫苗免疫效果IL2與藍(lán)耳疫苗與藍(lán)耳疫苗合用。合用。n 2、預(yù)防治療傳染病,腫瘤:腫瘤壞死因子,、預(yù)防治療傳染病,腫瘤:腫瘤壞死因子,干擾素,轉(zhuǎn)移因子。干擾素,轉(zhuǎn)移因子。n 3、構(gòu)建新基因工程疫苗,細(xì)胞因子插入疫、構(gòu)建新基因工程疫苗,細(xì)胞因子插入疫苗,可以增強(qiáng)免疫效果。苗,可以增強(qiáng)免疫效果。n(四)幾種重要的細(xì)胞因子(四)幾種重要的細(xì)胞因子nIL -1:淋巴細(xì)胞活化因子,活化多種免疫細(xì)胞淋巴細(xì)胞活化因子,活化多種免疫細(xì)胞nIL-2:T細(xì)胞生長(zhǎng)因子,也促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子,也促進(jìn)B細(xì)胞增殖,應(yīng)細(xì)胞增殖,應(yīng)用多。用多。nIL-4:B細(xì)胞刺激因子細(xì)胞刺激因子nIL-12:

20、B細(xì)胞產(chǎn)生的,促進(jìn)淋巴細(xì)胞成熟細(xì)胞產(chǎn)生的,促進(jìn)淋巴細(xì)胞成熟n干擾素:抗病毒,抗腫瘤,免疫調(diào)節(jié)。干擾素:抗病毒,抗腫瘤,免疫調(diào)節(jié)。 n二、二、CPGDNA(胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸)(胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸)n是非甲基化的是非甲基化的CPGDNA,也叫免疫刺激序列,也叫免疫刺激序列,作用是激活作用是激活NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖。n三、基因工程減毒素三、基因工程減毒素n通過基因工程技術(shù),切除毒素有害基因,然后通過基因工程技術(shù),切除毒素有害基因,然后在細(xì)胞中表達(dá),無毒,還有良好免疫原性。在細(xì)胞中表達(dá),無毒,還有良好免疫原性。n種類:霍亂毒素(種類:霍亂毒素(CT):粘膜免疫

21、佐劑,口服):粘膜免疫佐劑,口服免疫。免疫。n n大腸桿菌不耐熱腸毒素(大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT),也是粘膜免疫佐),也是粘膜免疫佐劑。劑。n 破傷風(fēng)類毒素(破傷風(fēng)類毒素(TT)注射疫苗佐劑。)注射疫苗佐劑。四、其它免疫佐劑四、其它免疫佐劑n(一)免疫刺激復(fù)合物(一)免疫刺激復(fù)合物(iscom)n 是抗原:皂苷:膽固醇是抗原:皂苷:膽固醇=1:1:1制成,為脂制成,為脂質(zhì)小泡,作用,提高抗原傳遞,可與多種疫苗質(zhì)小泡,作用,提高抗原傳遞,可與多種疫苗混合,還可以粘膜免疫?;旌?,還可以粘膜免疫。n(二)脂質(zhì)體(二)脂質(zhì)體 人工合成多層脂質(zhì)小體,包埋人工合成多層脂質(zhì)小體,包埋抗原,提高抗原傳遞???/p>

22、原,提高抗原傳遞。n(三)(三)MF59佐劑佐劑 4、3%角鯊?fù)榻酋復(fù)?0、5%吐溫吐溫80+0、5%司本司本85組成,多用于病毒疫苗佐劑,組成,多用于病毒疫苗佐劑,可刺激體液免疫也可以細(xì)胞免疫??纱碳んw液免疫也可以細(xì)胞免疫。n思考題:思考題:n什么叫佐劑?條件、作用原理是什么?什么叫佐劑?條件、作用原理是什么?n佐劑按物理性質(zhì),可分為哪些種類?佐劑按物理性質(zhì),可分為哪些種類?n什么叫弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑?什么叫弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑?n什么叫細(xì)胞因子?有何特點(diǎn)?主要有哪些?什么叫細(xì)胞因子?有何特點(diǎn)?主要有哪些?n常規(guī)佐劑有哪些?新型佐劑有哪些?常規(guī)佐劑有哪些?新型佐劑有哪些?n鋁膠和司本油類佐劑如何配制?鋁膠和司本油類佐劑如何配制?三、影響滅活作用的因素三、影響滅活作用的因素n(一)藥物的特異性:酚類不能殺滅真菌和病毒,陽離子的結(jié)晶紫,主要作用于G+菌。n(二)微生物的種類和特異性:G+菌和G-菌對(duì)藥物敏感不一樣,繁殖體和芽孢對(duì)藥物敏感也不一樣。n(三)藥物濃度:濃度愈大,滅活越快,抗原也損失大;但是,95%酒精沒75%酒精殺滅細(xì)菌好。n(三)保護(hù)劑的添加:一般是疫苗和保護(hù)劑1:1加入(5%蔗糖脫脂牛奶新城疫疫苗

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