生物學(xué)過程分子生物學(xué)

1、6A 基因組與基因組學(xué) 二十世紀(jì)人類科技史上產(chǎn)生了三大劃時(shí)代創(chuàng)舉：40年代第一顆原子彈爆炸、50年代人類首次登上月球、90年代人類基因組計(jì)劃實(shí)施。后者以10年光陰、30億美元的代價(jià)，測定了人類全套遺傳物質(zhì)30億對(duì)堿基的排列順序。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)者、美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）的J.D.Watson博士1990年在Science上撰文指出，與阿波羅登月計(jì)劃相比，雖然人類基因組計(jì)劃的資金投入少，但它對(duì)人類生活的影響卻可能更深遠(yuǎn)。事實(shí)正是如此，人類基因組計(jì)劃實(shí)施的二十幾年來，生命科學(xué)的研究與應(yīng)用發(fā)生了翻天覆地的變化，以基因組學(xué)為核心的各種組學(xué)學(xué)科應(yīng)運(yùn)而生。6A 基因組與基因組學(xué) 基因組學(xué)是研究

2、生物體基因組結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科。其中：a 基因組與基因組學(xué)的基本概念基因組學(xué)（Genomics） 對(duì)基因組物理結(jié)構(gòu)進(jìn)行測序和分析的研究，稱為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)； 整體水平上闡明各基因生物功能的研究，稱為功能基因組學(xué)，又稱為后基因組學(xué)?；蚪M（Genome） 一種生物全部基因（包括染色體、細(xì)胞器中所含的全套遺傳物質(zhì)）的集合稱為該生物的基因組。6A 基因組與基因組學(xué) b 基因組學(xué)的學(xué)科體系研究物種研究層次環(huán)境表觀比較功能結(jié)構(gòu)病毒細(xì)菌真菌植物動(dòng)物人類藥物營養(yǎng)毒理神經(jīng)疾病研究因子化學(xué)進(jìn)化寄生于人體內(nèi)的細(xì)菌種群：宏基因組學(xué)未改變基因組序列但顯示功能改變6A 基因組與基因組學(xué)c 基因組學(xué)的主要研究方式基因組學(xué)的主

3、要研究方式是啟動(dòng)并實(shí)施各種生物的基因組計(jì)劃?；蚪M計(jì)劃的主要工作任務(wù)是繪制各種圖譜。遺傳圖譜物理圖譜序列圖譜基因圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜表達(dá)圖譜功能圖譜進(jìn)化圖譜基因組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)代謝組學(xué)各種生物體蛋白質(zhì)的時(shí)空特異性表達(dá)譜制作；各種生物體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象分析；各種生物體蛋白質(zhì)之間的相互作用譜制作。各種生物體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究；蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）的研究內(nèi)容基于酵母雙雜交技術(shù)的蛋白質(zhì)之間相互作用探測程序 Y2H轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)DBADDBAD基因應(yīng)答元件啟動(dòng)子報(bào)告基因誘餌蛋白篩查蛋白基因文庫基于蛋白片段互補(bǔ)技術(shù)的蛋白質(zhì)之間相互作用探測程序 PCA酵母MAT-a單倍體細(xì)胞酵母MAT-a

4、單倍體細(xì)胞aa a交配氨甲喋呤平板氨甲喋呤平板二氫葉酸還原酶F1-2片段二氫葉酸還原酶F3片段誘餌蛋白篩查蛋白a-aa-a蛋白質(zhì)之間相互作用圖譜的制作與分析酵母芽頸生長過程酵母自我吞噬過程基于免疫共沉淀技術(shù)的蛋白質(zhì)-DNA相互作用探測程序 ChIP轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子組蛋白細(xì)胞核內(nèi)破碎細(xì)胞DNAase處理轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子特異性抗體免疫共沉淀釋放克隆測序篩查到98個(gè)p53的新結(jié)合位點(diǎn)6A 基因組與基因組學(xué)d 基因組學(xué)的研究進(jìn)展 截止到2004年9月，已有205種生物的基因組完成測序，其中包括：真核生物19種；原核生物167種；古細(xì)菌19種。另外，還有更多種類的生物體已完成基因組草圖甚至部分測序，如：牛、羊、

5、豬、狗、貓、雞、青蛙、海膽、蜜蜂、瘧蚊、蕃茄、苜蓿、燕麥、大麥、小麥、玉米、高梁、大豆等，微生物更是不不計(jì)其數(shù)。 截止到2006年底，基因組完成測序的生物累計(jì)已達(dá)1600余種。 從2010年起，國際上又啟動(dòng)了千人基因組計(jì)劃。 截止到2010年底，基因組完成測序的生物累計(jì)已達(dá)近5000種。6A 基因組與基因組學(xué)e 人類基因組的基本特征人類基因組的大小噬菌體大腸桿菌酵母擬南芥線蟲果蠅水稻老鼠人類玉米小麥百合阿米巴蟲2.0 x 105 bp6.0 x 1011 bp4.2 x 106 bp1.0 x 107 bp1.5 x 107 bp1.0 x 108 bp1.7 x 108 bp4.3 x 10

6、8 bp3.0 x 109 bp3.3 x 109 bp5.4 x 109 bp1.6 x 1010 bp5.0 x 1010 bp6A 基因組與基因組學(xué)e 人類基因組的基本特征人類基因組的結(jié)構(gòu) 人類基因組中含有大量的重復(fù)順序和高度重復(fù)順序，非重復(fù)順序只占總基因組的大約54-58%。例如，tRNA和rRNA編碼基因在人染色體DNA上的拷貝數(shù)分別為：18S / 28S rRNA編碼基因5S rRNA編碼基因tRNA編碼基因280200013006A 基因組與基因組學(xué)e 人類基因組的基本特征人類基因組的性質(zhì)人體基因總數(shù)約為 2.5 萬個(gè)95%以上的基因含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)每個(gè)基因的平均外顯子數(shù)為 7 個(gè)

7、基因的平均長度為 16.3 kbmRNA的平均長度為 2.2 kb6B 基因組圖譜的制作 基因組的遺傳和物理圖譜的制作有助于基因組的克隆與測序，它可以幫助人們將全套基因組以路標(biāo)的形式分割成小片段，進(jìn)行基因克隆、測序和鑒定，即所謂的 top-down 戰(zhàn)略；如果將基因組DNA隨機(jī)打斷成片段，全部測序后，依據(jù)序列重疊性重新拼在一起，完成整條染色體上的DNA排列順序，這就是所謂的 bottom-up 戰(zhàn)略。 基因組圖譜主要有四種，即遺傳圖譜、物理圖譜、功能圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜。遺傳圖譜是染色體的定性路標(biāo)，而物理圖譜則是定量路標(biāo)。6B 基因組圖譜的制作a 遺傳圖譜與物理圖譜的基本概念 遺傳圖譜又稱連鎖圖譜，

8、是指基因或DNA標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離，后者通常以基因或DNA標(biāo)記在染色體重組交換過程中的分離頻率厘摩（cM）表示。cM值越大，兩者之間距離越遠(yuǎn)。遺傳圖譜制作時(shí)所涉及基因或DNA標(biāo)記越多，越密集，所得到的遺傳圖譜的分辨率也就越高。 基因組的遺傳圖譜6B 基因組圖譜的制作a 遺傳圖譜與物理圖譜的基本概念 物理圖譜是指基因或DNA標(biāo)記在染色體上的實(shí)際排列順序位置，通常以已知核苷酸序列的DNA片段（如：序列標(biāo)簽位點(diǎn)，sequence-tagged site，STS；或限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)）為“路標(biāo)”，以堿基對(duì)（bp、kb、Mb）作為基本測量單位（圖距），對(duì)基因組進(jìn)行作圖?；蚪M的物理圖譜

9、6B 基因組圖譜的制作 生物體內(nèi)的DNA和染色體普遍存在著同源重組現(xiàn)象。同源重組的頻率首先取決于兩條染色體或DNA雙鏈的同源性程度；在相同的同源性情況下，重組頻率又取決于兩遺傳位點(diǎn)（或基因之間的）距離，相b 利用遺傳重組法繪制遺傳圖譜距越遠(yuǎn)重組頻率越高。 就人體而言，在授精卵細(xì)胞中共有23對(duì)染色體，每對(duì)染色體的一條來自精細(xì)胞，另一條來自卵細(xì)胞。每對(duì)中的兩條染色體互為同源染色體，相對(duì)應(yīng)的基因稱為等位基因。同源染色體在授精之后胚胎發(fā)育之前，會(huì)發(fā)生同源重組。遺傳同源重組機(jī)制Aa、Gg等互為等位基因，如果它們兩兩之間不是100%同源，那么經(jīng)同源重組后，g等就不再與a等同存（連鎖）于一條染色體上，它們將

10、出現(xiàn)于不同的子代個(gè)體中，并表現(xiàn)出不同的性狀，即孟德爾遺傳規(guī)律。根據(jù)兩個(gè)性狀在第A B C D E F G H I Ja b c d e f g h i jA B C D E f g h i ja b c d e F G H I J重組A B C D E F G H I Ja b c d e f g h i jA B C D E f g h i ja b c d e F G H I J分離交配分離交配三代中的分離連鎖頻率，即可知道其重組頻率。重組頻率愈高的兩個(gè)性狀，其基因位點(diǎn)在原來親本染色體上的距離也就越遠(yuǎn)。通過多對(duì)性狀的比較，即可測定其基因位點(diǎn)的前后相對(duì)排列順序。上世紀(jì)初，摩爾根和他的研究生就

11、是用這種方法研究果蠅的遺傳圖譜的，到1915年，他們?cè)诠壢旧w上已排定了85個(gè)遺傳位點(diǎn)的順序。6B 基因組圖譜的制作 人細(xì)胞與嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞通過細(xì)胞融合技術(shù)可形成雜合細(xì)胞。在這種雜合細(xì)胞中，人染色體會(huì)隨著雜合細(xì)胞的增殖分裂而逐漸丟失，并可分離到含有單一人染色體的雜合細(xì)胞。該細(xì)胞本質(zhì)上是鼠的，含有正常的次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（HPRT）。這個(gè)基因的產(chǎn)物催化次黃嘌呤合成次黃嘌呤單核苷酸（IMP），IMP可在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化c 利用照射雜交法繪制遺傳圖譜成AMP和GMP。照射雜交法操作程序含單一人染色體的雜合細(xì)胞用X射線照射，所有染色體均被打斷成8 Mb長的小片段，雜合細(xì)胞被殺死。然后將之與HPRT

12、-的中國倉鼠細(xì)胞融合，融合細(xì)胞一般只含有兩三個(gè)染色體碎片，不同的融合細(xì)胞含有不同的人染色體片段。最后再用一組人的DNA探針雜交融合細(xì)胞的染色體DNA片段。哪一對(duì)標(biāo)記探針在同一融合細(xì)胞中同時(shí)呈雜交陽性的出現(xiàn)頻率越大，它們彼此就靠得越近，反之亦然。這樣，即可排出這這些標(biāo)記的前后排列順序。人的第18號(hào)染色體就是用此法制作了40Mb的遺傳圖譜。 X-射線照射細(xì)胞融合探針雜交人鼠雜合細(xì)胞HPRT缺陷型中國倉鼠細(xì)胞倉鼠融合細(xì)胞人染色體探針6B 基因組圖譜的制作 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）技術(shù)特別適用于突變基因在染色體上

13、的定位。其工作原理如下：基因突變會(huì)導(dǎo)致分子病尤其是遺傳病的發(fā)生。這些突變包括核苷酸堿基點(diǎn)突變、缺失、插入，它們很可能在導(dǎo)致基因突變的同時(shí)，也使得限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)發(fā)生變化，從而改變限制性內(nèi)切酶酶解片段的長度。因而通過正常人與病人染色體酶切片段長度的對(duì)比d 利用RFLP法繪制遺傳圖譜分析，便可找到突變基因，并將之定位于染色體的某一片段上。RFLP的工作原理 相同區(qū)條帶： 正常人與病人均存在的帶譜，反映人種基因組的相似性 離散區(qū)條帶： 正常人與病人均不相同的帶譜，反映人個(gè)體基因組的差異性 病變區(qū)條帶： 正常人與病人分別具有相同的特征帶譜，但兩者之間的相同區(qū)A B C D E F G H I 離散區(qū)

14、相同區(qū)病變區(qū)帶譜顯著不同，病變基因就位于這些條帶上正常人病人DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜杜興肌營養(yǎng)不良癥的病理杜興肌營養(yǎng)不良（Duchenne Muscular Dystrophy）癥是因?yàn)榛颊叩腄MD基因突變?cè)斐傻?，該基因編碼Dystrophin蛋白。DMD病變基因的突變位點(diǎn)正好處于DNA上BglII的酶切位點(diǎn)內(nèi)（AGATCTAGGTCT），從而使得病人的該BglII位點(diǎn)消失，形成一個(gè)30kb的BglII片段，而正常人則為8kb和22kb兩個(gè)BglII限制性片段6B 基因組圖譜的制作 高等真核生物的染色體DNA上存在著大量的重復(fù)序列，如長度在15-65bp范圍內(nèi)的小衛(wèi)星DNA、長度在2-6bp范

15、圍內(nèi)的微衛(wèi)星DNA，后者又稱為簡短串聯(lián)重復(fù)序列（SSR）。以SSR兩側(cè)的已知序列為引物，PCR擴(kuò)增這一SSR序列，經(jīng)測序便可鑒定該SSR的長度及重復(fù)單位數(shù)。通過對(duì)多個(gè)SSR序列的遺傳連鎖分析，即可測定這些SSR標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置。1996年，利用上述原理繪制出的人類染色體完整連e 利用PCR擴(kuò)增法繪制遺傳圖譜鎖圖譜，相鄰標(biāo)記間的平均距離僅0.7厘摩。SSR1 SSR2SSR3SSR4SSR56B 基因組圖譜的制作PFGE：Pulsed Field Gel Electrophoresis，即脈沖場凝膠電泳。遺傳圖譜是在染色體DNA上標(biāo)注基因或遺傳位點(diǎn)相對(duì)位置；而物理圖譜則是標(biāo)注限制性內(nèi)切酶

16、位點(diǎn)或已知DNA片f 利用PFGE法繪制物理圖譜NSWE段的實(shí)際位置。特大型DNA片段的制備 將細(xì)胞包埋在低溫灌注的凝膠中；凝膠塊用蛋白酶K、RNA酶（不含DNAase）處理，DNA在被固定后基本上不因剪切力而斷裂；然后整個(gè)凝膠塊用哺乳動(dòng)物DNA上稀有的限制性內(nèi)切酶消化，如NotI（GC / GGGCCGC）、Sfi I（GGCCNNNN / NGGCC）等。經(jīng)這兩種酶分別酶切后，染色體DNA斷裂成幾百甚至幾千kb的大片段。 特大型DNA片段的分離 采用PFGE技術(shù)可將200至3,000 kb的DNA片段分開。消化后的凝膠塊直接放入PFGE普通凝膠孔內(nèi)，上千kb的DNA片段通常需要連續(xù)走幾天電

17、泳才能分開。隨機(jī)探針原位雜交人的第21號(hào)染色體的三種限制性酶切圖譜就是采用這一技術(shù)制作的。 部分酶解 全酶解 1700 kb 1400 kb 1200 kb 1000 kb 700 kb 200 kb S1探針雜交 S2探針雜交 S3探針雜交 17001400700120010002006B 基因組圖譜的制作g 利用DNA克隆片段的重疊性繪制物理圖譜 如果某一生物體的染色體DNA已被全部克隆，便可以借助于下列三種實(shí)驗(yàn)程序，確定每個(gè)克隆中的DNA片段的排列順序，由此構(gòu)成以酶切片段末端標(biāo)記法克隆編號(hào)為標(biāo)記的基因組物理圖譜。隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法染色體走讀排序法C159C094C436C512C298C

18、777酶切片段末端標(biāo)記法HHHHS S SSSSSSSSSSSSS SSSS單一克隆指紋圖譜十克隆指紋圖譜載體DNA克隆DNA 將若干克隆固定在薄膜上，并復(fù)制20份薄膜；合成20種不同序列的短探針，其序列是隨機(jī)的；用20種探針隨機(jī)定位雜交（一對(duì)一）20份克隆薄膜；如果某兩個(gè)克隆同時(shí)對(duì)同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng)，則這兩個(gè)克隆有可能是相互重疊的。若將陽性記為“1”，而陰性記為“0”，隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法這樣便可將結(jié)果清晰地列成一張表，最終排出上述克隆的排列順序。0102030405060708091011121314151617181920A B CD E FG01 02 03 04 0506 07

19、 08 09 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20DABCEFG11111111111111111111111111111101 04 12 06 1314 02 14 07 19 1115 05 08 16 03 10 09 20 18DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB染色體走讀排序法 從基因文庫中任取一個(gè)克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將之兩端序列 分別以上述亞克隆DNA片段為探針，雜交同一基因文庫，陽性克分別亞克隆，亞克隆片段在0.5 - 2.0 kb范圍內(nèi)。 然后再以陽性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，

20、直至隆中的插入DNA片段必定與起點(diǎn)克隆所含的DNA片段連鎖在一起。 線型染色體DNA的端點(diǎn)。走讀的起點(diǎn)克隆片段染色體走讀排序法走讀的起點(diǎn)克隆片段亞克隆旁測序列探針標(biāo)記第一輪雜交陽性克隆陽性克隆第二輪雜交第二輪雜交6C 基因組文庫的構(gòu)建 原核生物的基因文庫大都采用l-DNA或Cosmid載體構(gòu)建，但若用Cosmid構(gòu)建人的基因組文庫，工作量太大，幾乎難以進(jìn)行。目前已發(fā)展了用酵母人造染色體（YAC）或細(xì)菌人造染色體（BAC）克隆幾百甚至上千kbDNA大片段的技術(shù)，這樣可大大簡化構(gòu)建人基因組文庫的工作量。例如，要求人基因組文庫的完備性為99.999%，若用Cosmid（裝載量為40kb）構(gòu)建一條人染

21、色體的基因組文庫（平均長度為150Mb），則需要4.3104個(gè)克隆；而用YAC載體構(gòu)建則僅需4.3103個(gè)克隆，相當(dāng)于將整條染色體DNA克隆10-15次。6C 基因組文庫的構(gòu)建a 用于大型基因組文庫構(gòu)建的克隆載體 開發(fā)裝載量在100-1000kb范圍內(nèi)的克隆載體是基因組計(jì)劃實(shí)施的酵母人造染色體（YAC）重要條件。目前已發(fā)展了多種用于克隆大型DNA片段的特殊載體：細(xì)菌人造染色體（BAC）噬菌體人造染色體（PAC）可轉(zhuǎn)化人工染色體（TAC）人類人工染色體（HAC）6C 基因組文庫的構(gòu)建a 用于大型基因組文庫構(gòu)建的克隆載體酵母人造染色體（YAC）細(xì)菌人造染色體（BAC）噬菌體人造染色體（PAC）可轉(zhuǎn)

22、化人工染色體（TAC）人類人工染色體（HAC）用于構(gòu)建大型基因組文庫的克隆載體的性能人造染色體類型載體名稱復(fù)制子類型最大裝載量pBeloBAC11大腸桿菌F性因子酵母自主復(fù)制序列2000 kbpYAC4P1噬菌體DNA復(fù)制子300 kb150 kbpYLTAC17P1和Ri質(zhì)粒復(fù)制子100 kbpCYPAC1人染色體DNA復(fù)制子6000 kbYAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的復(fù)制子 pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復(fù)制起始位點(diǎn) 酵母染色體的中心粒序列 酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC載體的一般裝

23、載量為350-400 kb，最高可達(dá)2000 kb。酵母人造染色體載體pYAC4酵母染色體的端粒序列 6C 基因組文庫的構(gòu)建b 單一染色體的分離純化 細(xì)胞培養(yǎng)物用有絲分裂抑制劑乙酰甲基秋水仙堿處理；有絲分裂停止了的細(xì)胞松散地貼在培養(yǎng)皿的底面上，稍稍抖動(dòng)，即可將之收集到試管中；將細(xì)胞懸浮在染色體分離緩沖液中處理，以維持染色體結(jié)構(gòu)，同時(shí)滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶；染色體用DNA特異性染料染色，AT富含區(qū)由Hchst 33258染色，GC富集區(qū)為色霉素A染色。 染了色的染色體在合適波長下會(huì)發(fā)出熒光，Hchst染料的發(fā)光波長為351和363nm；色霉素A染料的發(fā)光波長為458nm。染了色的染色體由于DNA堿基排

24、順列序的差異而顯示出不同的染料量比例和染色區(qū)域，從而構(gòu)成每條染色體的特征性熒光譜。染色體的染色熒光激活細(xì)胞分類儀 當(dāng)染色體溶液進(jìn)入熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS）后，在兩種波長激光的照射下發(fā)出熒光，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并在染色體溶液中通電使染色體帶電。然后通過電場收集單一染色體，并由電腦識(shí)別之。由于人的第9-12號(hào)染色體之間的差別不大，因此用FACS難以將之分開。 收集細(xì)胞低滲裂解細(xì)胞進(jìn)柱分離紫外激光發(fā)生器可見激光發(fā)生器6C 基因組文庫的構(gòu)建c 從單一染色體上分離純化DNA片段 利用超精細(xì)玻璃針在光學(xué)顯微鏡下將染了色的染色體各區(qū)帶切開，并挑出染色體碎片；將染色體片段用蛋白酶消化，苯酚

25、提取，乙醇沉淀，即可用于基因的定位克隆。從20條單一的人染色體上大約能獲得0.3pg（0.310-12 g）的DNA，這在克隆實(shí)驗(yàn)中已足夠。 6C 基因組文庫的構(gòu)建d YAC基因組文庫的構(gòu)建程序單一染色體DNA用EcoRI部分酶解，PFGE電泳分離，切下350-400kb的條帶，提純DNA片段，或者密度梯度離心，除去300kb以下的DNA片段；pYAC載體用 EcoRI / BamHI 聯(lián)合酶解，分離出長短臂；將DNA大片段與載體的兩個(gè)臂相連； 重組DNA分子電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌球形體； 利用篩選標(biāo)記篩選重組子，重組YAC具有與天然酵母染色體相似的性質(zhì)，復(fù)制一次并進(jìn)行有絲分裂。YAC克隆DNA片

26、段的程序 按上述程序獲得大片段的基因組文庫之后，再利用DNA克隆片段的重疊性，以酶切片段末端標(biāo)記法、隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法、或染色體走讀排序法繪制物理圖譜。6D 基因組序列的測定 DNA測序技術(shù)自Sanger于1977年發(fā)明的雙脫氧末端終止法以來，先后經(jīng)歷了凝膠電泳測序、毛細(xì)管電泳測序、高通量平行測序三大技術(shù)革新。30多年前基于Sanger雙脫氧末端終止法的手工測序能應(yīng)付細(xì)菌基因組的分析，但已無法直接滿足人類基因組測序的要求。一個(gè)訓(xùn)練有素的DNA測序員最快一天只能測定1kb的DNA片段，為了使誤測率減小至最低程度，每個(gè)DNA片段兩個(gè)方向至少共需測四次，即1kb的DNA片段一人需花四天時(shí)間才能完成！

27、這還不包括模板克隆所花的時(shí)間，而后者花費(fèi)的時(shí)間通常比測序更多。因此，必須發(fā)展新一代的DNA高速測序方法。目前實(shí)驗(yàn)室成熟或正在發(fā)展的DNA高速廉價(jià)測序方法包括：a 基于雙脫氧末端終止法的全自動(dòng)測序戰(zhàn)略KlenowOH 35 PTdNTP + ddATP TTTTTOH 35 P傳統(tǒng)的Sanger雙脫氧末端終止法程序A C G T 聚丙烯酰胺A G T C 凝膠電泳DNA聚合測序反應(yīng)克隆待測DNA片段OHHN閱讀序列TACGACTCAGGATTGAC . 改進(jìn)的全自動(dòng)測序戰(zhàn)略采用同樣測序原理，但在進(jìn)行四個(gè)DNA聚合反應(yīng)時(shí)使用標(biāo)記四種不同熒光基團(tuán)的測序引物，這使得四個(gè)聚合反應(yīng)物可混合在一起進(jìn)行毛細(xì)管

28、電泳分離，并可利用儀器自動(dòng)識(shí)別閱讀，從而大幅度提高測序的速度和精度。一臺(tái)全自動(dòng)測序儀每小改進(jìn)的全自動(dòng)測序戰(zhàn)略時(shí)可測7kb，出錯(cuò)率僅為10-4。6D 基因組序列的測定b 基于DNA合成的單核苷酸加入測序戰(zhàn)略 2005年底，美國454生命科學(xué)公司的Jonathan Rothberg及其同事推出了全新的基于DNA合成的超高通量測序系統(tǒng)，這套價(jià)格50萬美元的系統(tǒng)連續(xù)閱讀長度為330bp，可在8小時(shí)內(nèi)完成450Mb的DNA測序工（1）待測DNA樣品（模板）的預(yù)處理作！整個(gè)測序流程由下列四個(gè)環(huán)節(jié)組成：（2）待測DNA樣品（模板）的PCR擴(kuò)增（3）DNA測序反應(yīng)（4）數(shù)據(jù)處理與分析6D 基因組序列的測定b

29、基于DNA合成的單核苷酸加入測序戰(zhàn)略待測DNA樣品（模板）的預(yù)處理A 接頭B 接頭高壓氣流隨機(jī)打斷400-600 bp片段兩端連接擴(kuò)增和測序接頭6D 基因組序列的測定b 基于DNA合成的單核苷酸加入測序戰(zhàn)略待測DNA樣品的固相乳膠PCR擴(kuò)增（emPCR）變性結(jié)合包裹水油乳膠微泡釋放隨機(jī)打斷微型磁珠6D 基因組序列的測定b 基于DNA合成的單核苷酸加入測序戰(zhàn)略多重DNA測序反應(yīng)3 T-C-G-A-G-G-G-A-C-C-A-G-T-C-G-T-A-5 A-G-C-T-C-C-GpppTPPi + APSsulfurylaseATPluciferaseluciferinoxy-luciferin

30、+ hv皮升板160萬孔6D 基因組序列的測定c 基于DNA合成的循環(huán)可逆終止測序戰(zhàn)略待測DNA樣品的固相橋式PCR擴(kuò)增雙向引物均交聯(lián)在載玻片上6D 基因組序列的測定c 基于DNA合成的循環(huán)可逆終止測序戰(zhàn)略DNA的循環(huán)可逆終止的合成3-阻斷型的可逆終止核苷酸；四色熒光基團(tuán)；核苷酸摻入后，洗去未反應(yīng)的游離核苷酸，檢測熒光信號(hào)，隨后再利用特殊試劑分別除去信號(hào)基團(tuán)和阻斷基團(tuán)，恢復(fù)3-OH。6D 基因組序列的測定c 基于DNA合成的循環(huán)可逆終止測序戰(zhàn)略DNA的循環(huán)可逆終止的合成3-非阻斷型的可逆終止核苷酸；四色熒光基團(tuán)；抑制堿基摻入6D 基因組序列的測定d 基因芯片測序法 基因芯片是固定在玻璃、紙張、

31、尼龍等固體平面上的寡聚核苷酸點(diǎn)陣（DNA Array，Genechip）。合成一定長度（12-24bp）的寡聚核苷酸全排列探針，分別固定在已知位置的芯片上。待測序DNA樣品經(jīng)處理（如超聲波），形成一定長度的片段，標(biāo)記熒光基團(tuán)；然后與上述全排列芯片進(jìn)行雜交；雜交后的芯片清洗條件控制在只允許與DNA樣品100%配對(duì)的探針存在與芯片上；最后送入閱讀儀檢測，電腦識(shí)別雜交陽性熒光斑點(diǎn)，并根據(jù)芯片探針序列排列DNA的堿基順序?；蛐酒瑴y序原理ATCGAAG C A T G TTCGAAG C A T G T CTCGAG C A T G T C ATCAG C A T G T C A CGCAG C A

32、T G T C A CGC G C A T G T C A CGGG C A T G T C A CG TGC A T G T C A CG T CGA T G T C A CG T C AGT G T C A CG T C A CGG T C A CG T C A C TGT C A CG T C A C T T TAGCTTC G T A C AAAGG T G C C A G T G A A C熒光標(biāo)記基團(tuán)待測DNA樣品探針基因芯片 基因芯片目前還無法用于測序，原因是點(diǎn)陣的集成度遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到要求。對(duì)于高等哺乳動(dòng)物基因組的測序而言，芯片上的探針長度至少應(yīng)在24個(gè)堿基，這樣探針的全排列總數(shù)高達(dá)

33、 3X1014（424）！而目前基因芯片能達(dá)到的最大集成度芯片測序法的限制只有1X109。6D 基因組序列的測定遵循信息科學(xué)界的遵循信息科學(xué)界的“摩爾定摩爾定理理”十年間測序成本降低十萬倍十年間測序成本降低十萬倍6E 基因組結(jié)構(gòu)的解析 基因組DNA序列分析全部完成之后，人們即獲得了基因組的序確定基因的位置，繪制基因圖譜（結(jié)構(gòu)基因組學(xué)）；列圖譜。接下來的任務(wù)便是：確定基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)空特異性，繪制轉(zhuǎn)錄圖譜和表達(dá)圖譜；確定基因的功能，繪制功能圖譜（功能基因組學(xué)）。6E 基因組結(jié)構(gòu)的解析a 在染色體DNA上定位基因 人染色體DNA上的基因（尤其是蛋白質(zhì)編碼基因）排列得非常松散，以每個(gè)基因平均長度16kb

34、、共22.5萬個(gè)基因計(jì)算，基因區(qū)不足DNA總長的10%，且其中只有14%的DNA序列是基因編碼區(qū)，而其它部分均為內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。因而，即便獲得了基因組DNA的序列，要想知道各基因的準(zhǔn)確位置，也不是件容易的事。目前，已建立了多種有效測蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子邊界的方法。動(dòng)物園雜交法（Zoo blot） 由于進(jìn)化的原因，人體內(nèi)絕大部分的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因在其它哺乳類動(dòng)物體內(nèi)均存在，且具有高度的同源性。因而，在靶基因區(qū)域內(nèi)任取若干DNA小片段為探針，雜交各種動(dòng)物的DNA基因組。凡是在許多動(dòng)物基因組上均有陽性反應(yīng)的DNA探針片段，便極有可能是外顯子，而內(nèi)含子序列在動(dòng)物種屬之間通常是無同源性的。一旦一個(gè)基因的外顯

35、子全部找到，整個(gè)基因的左右邊界便可確定。GC島探測法 人類基因轉(zhuǎn)錄單位的上游，存在著GC豐富區(qū)，這一區(qū)域的DNA片段可用那些識(shí)別序列中富含GC的內(nèi)切酶消化，能切開的地方很有可 能是基因的上游鄰近區(qū)。例如：Apa I（GGGCCC）Nar I （GGCGCC）Xma III（CGGCCG）Sma I （CCCGGG）Sst II （CCGCGG）BssH II（GCGCGC）外顯子擴(kuò)增法 將克隆的DNA片段插入到某一基因的兩個(gè)外顯子之間，并接在哺乳動(dòng)物載體上，轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞。從中分離純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，PCR擴(kuò)增，電泳比較cDNA片段大小。若克隆的DNA片段含有外顯子，則cDNAE1

36、E2Intron待測片段重組轉(zhuǎn)錄剪切反轉(zhuǎn)錄DNAhnRNAmRNAcDNA應(yīng)比兩個(gè)外顯子更長。cDNA雜交對(duì)比定位法 以生物體特定組織或細(xì)胞的cDNA芯片雜交克隆的基因組DNA片段，雜交陽性的DNA克隆序列即為蛋白質(zhì)編碼基因。 6E 基因組結(jié)構(gòu)的解析b 確定基因的時(shí)空特異性表達(dá)譜生物體 肝臟 大腦 血液 神經(jīng) 心臟 紅細(xì)胞 噬中粒 噬酸粒 噬堿粒 血小板 G0 期 G1 期G2 期S 期 M 期基因組定位 cDNA文庫6E 基因組結(jié)構(gòu)的解析c 確定基因的生物功能模式生物 基因定點(diǎn)敲除 gene knock-out基因定向?qū)?gene knock-inLoss-of-FunctionGain-

37、of-Function6F 系統(tǒng)生物學(xué)的內(nèi)涵a 系統(tǒng)生物學(xué)的研究內(nèi)容 系統(tǒng)生物學(xué)是從系統(tǒng)水平上了解生命本質(zhì)，利用綜合性的原理、方法、技術(shù)研究分子行為與系統(tǒng)特性之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而借助于計(jì)算生物學(xué)工具定量闡明和預(yù)測生物的功能、表型、行為。 系統(tǒng)生物學(xué)將孤立的基因和蛋白質(zhì)水平上的各種相互作用、各種代謝途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方面的信息整合起來，用以表征生物整體的性狀和過程，因此系統(tǒng)生物學(xué)是生命科學(xué)中的大科學(xué)。6F 系統(tǒng)生物學(xué)的內(nèi)涵b 系統(tǒng)生物學(xué)的研究策略細(xì)胞組織個(gè)體物理因子化學(xué)因子生物因子擾動(dòng)檢測基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白組代謝組調(diào)控組6F 系統(tǒng)生物學(xué)的內(nèi)涵c 基于轉(zhuǎn)錄機(jī)器擾動(dòng)的系統(tǒng)生物學(xué)研究案例原核生物的s

38、s因子識(shí)別啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)TATA-BOXTBPTAFs真核生物的 TFIID 復(fù)合物識(shí)別啟動(dòng)子全轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程 Global transcription machinery engineering gTMEAlper Stephanopoulos：Metabolic Engineering. 9. 258. 2007大腸桿菌s s70因子的編碼基因 rpoDrpoD 基因突變文庫大腸桿菌s s70因子突變株導(dǎo)入s s70因子變體內(nèi)源性s s70因子易錯(cuò)PCR擾動(dòng)乙醇耐受性突變株的篩選Alper Stephanopoulos：Metabolic Engineering. 9. 258. 2007紅

39、色：突變株藍(lán)色：對(duì)照株突變株與對(duì)照株的系統(tǒng)生物學(xué)比較 利用基因芯片定量分析對(duì)照株和突變株分別在乙醇存在和不存在時(shí)的基因轉(zhuǎn)錄譜。分子伴侶休克蛋白膜壓力感應(yīng)藥物響應(yīng)外膜蛋白F琥珀酸脫氫酶氮源代謝阿洛糖結(jié)合蛋白磷酸核糖異構(gòu)酶超氧化岐化酶小調(diào)控型RNA順戊頭酸酶核糖體小亞基鐵蛋白外膜蛋白W對(duì)照株突變株考試時(shí)間：公元 2012 年 1 月 5 日 周四 下午 1 : 30 - 3 : 30答疑時(shí)間：公元 2012 年 1 月 3 、4 日，9 : 00 - 22 : 00考試地點(diǎn)：八教 110 和 207 室答疑地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)十四樓對(duì)面小白宮二樓 導(dǎo)師辦公室 試題類型：術(shù)語解釋（20%） 四重單選（50%） 簡述分析（30%） 聯(lián)系方式：642525156C 基因組文庫的構(gòu)建 原核生物的基因文庫大都采用l-DNA或Cosmid載體構(gòu)建，但若