第二章 基因工程制藥1

1、 第二章第二章 基因工程制藥基因工程制藥 Chapter 2 Gene Engineering for Pharmacon 基因工程基因工程: 是通過(guò)對(duì)是通過(guò)對(duì)Nucleic acid 分子的分子的Insert, Assemble and Recombinant而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)（germ plasm）的重新組合，再借助的重新組合，再借助Virus , Bacterium ,Plasmid or other Vectors,將將Target gene轉(zhuǎn)移到新的轉(zhuǎn)移到新的 Host Cell System,并使并使Target Gene在新的在新的Host cell system 進(jìn)行

2、進(jìn)行Replication and Expression的技術(shù)。的技術(shù)。 基因工程技術(shù)最成功的成就基因工程技術(shù)最成功的成就:用于新型生物用于新型生物技術(shù)藥物的研制技術(shù)藥物的研制 A A、材料來(lái)源困難或制造技術(shù)問題而無(wú)法付諸應(yīng)用；、材料來(lái)源困難或制造技術(shù)問題而無(wú)法付諸應(yīng)用； B B、從動(dòng)物臟器中提取出來(lái)，也因造價(jià)太高，或因來(lái)、從動(dòng)物臟器中提取出來(lái)，也因造價(jià)太高，或因來(lái) 源困難而供不應(yīng)求；源困難而供不應(yīng)求； C C、由于免疫抗原、由于免疫抗原, ,病毒感染等緣故，使它們?cè)谑褂蒙喜《靖腥镜染壒剩顾鼈冊(cè)谑褂蒙?受到限制。受到限制。 一、傳統(tǒng)制藥存在的問題：傳統(tǒng)制藥存在的問題：1 1、可大量生產(chǎn)過(guò)去難

3、以獲得的生理活性多肽和蛋白、可大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性多肽和蛋白 質(zhì)，為臨床使用提供有效的保障；可避免免疫原質(zhì)，為臨床使用提供有效的保障；可避免免疫原 性及病毒污染（人生長(zhǎng)激素性及病毒污染（人生長(zhǎng)激素 克雅病克雅病CJDCJD） 2 2、可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生、可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生 理生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物理生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物 質(zhì)的應(yīng)用范圍；質(zhì)的應(yīng)用范圍； 3 3、利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性、利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性 生理活性物質(zhì)；生理活性物質(zhì)； 二、基因工程在生物技術(shù)制藥

4、中的作用二、基因工程在生物技術(shù)制藥中的作用4、內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不、內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處，可以通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改足之處，可以通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造；白細(xì)胞介素造；白細(xì)胞介素-2,125半胱氨酸半胱氨酸絲氨絲氨 酸提高活酸提高活性及穩(wěn)定性；性及穩(wěn)定性；tPA縮小分子延長(zhǎng)半衰期縮小分子延長(zhǎng)半衰期5、 利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源。篩選來(lái)源。6、為新藥研發(fā)提供了新途徑和新技術(shù)，極大、為新藥研發(fā)提供了新途徑和新技術(shù)，極大的提高了藥物研發(fā)速度，縮短藥物研發(fā)速的提高了藥物

5、研發(fā)速度，縮短藥物研發(fā)速度。度。 7、促進(jìn)傳統(tǒng)制藥工業(yè)的技術(shù)改造，為制藥工、促進(jìn)傳統(tǒng)制藥工業(yè)的技術(shù)改造，為制藥工業(yè)提供新技術(shù)業(yè)提供新技術(shù) 1976年世界第一家應(yīng)用DNA重組技術(shù)研究新藥的公司美國(guó)Genentech公司成立。 1982年歐洲首先批準(zhǔn)DNA重組的動(dòng)物疫苗抗球蟲病疫苗 1982，美國(guó)，英國(guó)批準(zhǔn)生產(chǎn)和使用了第一個(gè)基因工程藥物人胰島素?！?63863”高技術(shù)計(jì)劃在生物技術(shù)領(lǐng)域研究的三個(gè)主高技術(shù)計(jì)劃在生物技術(shù)領(lǐng)域研究的三個(gè)主題之一是：新型藥物、疫苗和基因治療，重點(diǎn)是題之一是：新型藥物、疫苗和基因治療，重點(diǎn)是利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，開發(fā)化學(xué)合成法難以生利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，開發(fā)化學(xué)合成法難以生

6、產(chǎn)的藥品。產(chǎn)的藥品。王大珩王大珩中國(guó)科學(xué)院院士，中國(guó)工程院院士，我國(guó)應(yīng)用光學(xué)及光學(xué)工程的主要奠基人之一。王淦昌王淦昌中國(guó)科學(xué)院院士、著名高能物理學(xué)家。楊嘉墀楊嘉墀中國(guó)科學(xué)院院士，著名空間自動(dòng)控制專家。 陳芳允陳芳允中國(guó)科學(xué)院院士，著名電子學(xué)家。“十五”期間，863計(jì)劃選擇了信息技術(shù)、生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)、新材料、先進(jìn)制造與自動(dòng)化技術(shù)、能源技術(shù)、資源環(huán)境技術(shù)等6個(gè)高技術(shù)領(lǐng)域 。1、免疫性蛋白：各種抗原和單克隆抗體2、細(xì)胞因子：干擾素，白介素，集落刺激 因子，表皮生長(zhǎng)因子及凝血因子。3、激素：胰島素，心鈉素，生長(zhǎng)激素。4、酶類：尿激酶，鏈激酶，葡激酶?；蚬こ趟幬锏纳a(chǎn)分為上游和下游兩個(gè)階段：基因工

7、程藥物的生產(chǎn)分為上游和下游兩個(gè)階段：上游階段上游階段：主要是分離目的基因、構(gòu)建工程菌(細(xì)胞)。目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達(dá)。選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)的量和分離純化的難易。 此階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。下游階段下游階段：從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。此階段是將實(shí)驗(yàn)室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等。 四、基因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程基因工程藥物

8、生產(chǎn)的基本過(guò)程 制制備備基基因因工工程程藥藥物物的的一一般般程程序序Get Target GeneConstruction Recombinant PlasmidConstruction Gene Engineering BacteriumCulture Engineering BacteriumSeparate and Purify the Products Filtration Bacteria Free IdentificationSemi-manufactured Goods Identification Finished Products Make up or Packaging基因

9、工程藥物的上游技術(shù)：基因工程藥物的上游技術(shù)： 1 1、基因克隆載體、基因克隆載體: :質(zhì)粒載體，質(zhì)粒載體， 2 2、重組、重組DNADNA技術(shù)的有關(guān)工具酶及其應(yīng)用技術(shù)的有關(guān)工具酶及其應(yīng)用 3 3、核酸制備技術(shù)：制備純凈、高質(zhì)量的、核酸制備技術(shù)：制備純凈、高質(zhì)量的 載體載體DNADNA和待克和待克隆的核酸，才能有效地進(jìn)行后續(xù)的酶切、反轉(zhuǎn)錄、連接等隆的核酸，才能有效地進(jìn)行后續(xù)的酶切、反轉(zhuǎn)錄、連接等分子克隆操作。分子克隆操作。 1 1）用堿抽提法分離質(zhì)粒）用堿抽提法分離質(zhì)粒DNADNA原理：細(xì)胞原理：細(xì)胞pH12.0-12.6線狀線狀DNA變性，變性，cccDNA不變性，加酸不變性，加酸恢復(fù)恢復(fù)pH

10、到中性，變性的染色體到中性，變性的染色體DNA交織成網(wǎng)而沉淀，上清交織成網(wǎng)而沉淀，上清用酚處理使蛋白變性，用醇沉淀質(zhì)粒用酚處理使蛋白變性，用醇沉淀質(zhì)粒DNA。 A）質(zhì)粒）質(zhì)粒DNA的小量制備的小量制備 B）質(zhì)粒）質(zhì)粒DNA的大量制備的大量制備 小量制備大量制備挑單菌落接種在2ml含抗菌素的 LB中，過(guò)夜將1ml培養(yǎng)物用0.5ml 水和Solution I 100ul 懸浮Solution II 200ul冰浴裂解Solution III 150ul恢復(fù)pH 酚/氯仿抽提 乙醇沉淀DNA用10ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種500ml含抗菌素的 LB, 37,振蕩，使OD600為0.81.0。離心回收菌體，用

11、50ml 水和Solution I 10ml 懸浮，加溶菌酶Solution II 20ml 冰浴裂解Solution III 15ml恢復(fù)pH 上清加0.6倍異丙醇，得沉淀 70乙醇洗DNA 酚/氯仿抽提 乙醇沉淀DNA2）染色體DNA的制備3）真核細(xì)胞RNA的制備4) DNA的凝膠(Agarose)電泳和 凝膠中DNA的 回收5) SDS-PAGE電泳和 凝膠中DNA的 回收 心 肝 脾 肺 腎 胃 腦 大腸睪丸 心 肝 脾 肺 腎 胃 腦 大腸卵巢 第二節(jié)第二節(jié) 目的基因的獲得目的基因的獲得目的基因的獲取途徑：目的基因的獲取途徑：化學(xué)合成法化學(xué)合成法二、二、 問題：來(lái)源于真核細(xì)胞的產(chǎn)生基

12、因工程藥物的目的問題：來(lái)源于真核細(xì)胞的產(chǎn)生基因工程藥物的目的基因，為什么不能進(jìn)行直接分離？基因，為什么不能進(jìn)行直接分離？一、化學(xué)合成法一、化學(xué)合成法 較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化學(xué)合成法獲得?；瘜W(xué)合成法有個(gè)化學(xué)合成法有個(gè)先決條件先決條件是是：必須知道目的基因的核苷酸排列順序，或知道目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序，再按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基系列。 方法方法：合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火連接成較長(zhǎng)的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。人工化學(xué)合成基因的人工化學(xué)合成基因的限制限制

13、： a. 不能合成太長(zhǎng)的基因。只適用于克隆小分子不能合成太長(zhǎng)的基因。只適用于克隆小分子肽的基因。肽的基因。 b. 人工合成基因時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并會(huì)為選人工合成基因時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并會(huì)為選擇密碼子帶來(lái)很大困難，擇密碼子帶來(lái)很大困難， 如用氨基酸順序推測(cè)核如用氨基酸順序推測(cè)核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完 全一全一致，易造成中性突變。致，易造成中性突變。 c. 費(fèi)用太高。費(fèi)用太高。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：可進(jìn)行密碼子的改造：可進(jìn)行密碼子的改造 逆轉(zhuǎn)錄法就是分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行cDNA 克隆表達(dá)。1、mRNA purificatio

14、n2、合成第一鏈cDNA3、cDNA第二鏈的合成4、cDNA cloning：5、將重組體導(dǎo)入host cell6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分離和鑒定 1、首先必須考慮目的基因mRNA在特定生物組織中的豐度，一般要選擇高豐度mRNA， 細(xì)胞內(nèi)RNA的組成和含量: DNA:95%核內(nèi)，5細(xì)胞器 RNA：75細(xì)胞質(zhì)，10%核內(nèi)，15%細(xì)胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5% 2、但實(shí)際操作時(shí)多用低豐度mRNA，為提高文庫(kù)中目的克隆數(shù)目，要采用雜交或體外翻譯系統(tǒng)確定RNA在組織細(xì)胞中的含量，以期得到較豐富的起始mRN

15、A，采用瓊脂糖凝膠電泳，非變性蔗糖梯度離心等方法分級(jí)收集不同長(zhǎng)度mRNA，富集目的序列。 3、抑制RNA酶活性 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAAAA AAAAAOligo(dT)纖維素纖維素Poly(A)-Oligo(dT)100mM NaCl洗脫rRNA/tRNA10mM Tris1mM EDTAPoly(A)mRNATotal RNA纖維素柱純化纖維素柱純化Poly(A)mRNAPoly(A)mRNA 流程圖流程圖真核細(xì)胞mRNA 的特點(diǎn)及分離純化方法。 3-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)2 2、合成第一鏈、合成第一鏈cDNAcDNA 一次好的

16、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使一次好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使oligo(dT)選出的選出的mRNA有有530%被拷貝。被拷貝。 1、 oligo(dT)引導(dǎo)的引導(dǎo)的cDNA合成法。缺點(diǎn)是合成法。缺點(diǎn)是必須從必須從3端起始，逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法到達(dá)端起始，逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法到達(dá)mRNA的的5端，對(duì)較長(zhǎng)的端，對(duì)較長(zhǎng)的mRNA難以操作。難以操作。 2、隨機(jī)引物引導(dǎo)的、隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法。根據(jù)多合成法。根據(jù)多種可能的序列合成出種可能的序列合成出6-10bp的混合物，從的混合物，從多位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行，較易獲得特長(zhǎng)多位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行，較易獲得特長(zhǎng)mRNA5端端的序列的序列5533反轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶（AMV)AMV)555533DNApol5

17、 53 3加接頭并連接到載體加接頭并連接到載體篩選重組體并在體外進(jìn)行表達(dá)篩選重組體并在體外進(jìn)行表達(dá)* *隨機(jī)引物合成隨機(jī)引物合成cDNAcDNAS1 S1 核酸酶核酸酶mRNAmRNA此法是根據(jù)可能的序列合成出610個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸短片段（混合物）作為合成第一鏈cDNA的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生，而不僅僅從3末端的oligo(dT)引物一處開始。研究工作證實(shí)，對(duì)于特長(zhǎng)的mRNA分子中的靠近5端序列，應(yīng)用這種方法是比較容易得到克隆的。3、cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 1.自我引導(dǎo)合成法：堿水解mRNA，發(fā)卡引 導(dǎo)第二鏈的合成，S

18、1核酸酶必須是高純度的，否則由于單鏈切割作用導(dǎo)致5端信息丟失，極少采用。 2、RNaseH降解取代法： 3、外加引物合成法3 3、合成第二鏈、合成第二鏈cDNAcDNA55帽狀結(jié)構(gòu)帽狀結(jié)構(gòu)PolyAPolyA尾巴尾巴33polyTpolyT反轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶（AMV)AMV)55帽狀結(jié)構(gòu)帽狀結(jié)構(gòu)PolyAPolyA尾巴尾巴33polyTpolyT555533polyApolyADNApolDNApolpolyApolyA5 53 3連接到載體連接到載體篩選重組體并在體外進(jìn)行表達(dá)篩選重組體并在體外進(jìn)行表達(dá)* *置換法合成置換法合成cDNAcDNAPolyATPolyATPolyTPolyTmRN

19、AmRNA磷酸鈉磷酸鈉RNaseRNase H H5 55 55 55 55 5RNaseH降解取代法全長(zhǎng)全長(zhǎng)cDNAcDNA鏈的合成鏈的合成55帽狀結(jié)構(gòu)帽狀結(jié)構(gòu)PolyPolyA A尾巴尾巴33polyTpolyT- -限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶反轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶（AMV)AMV)55帽狀結(jié)構(gòu)帽狀結(jié)構(gòu)PolyPolyA A尾巴尾巴33polyTpolyT- -限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶555533堿水解法堿解堿水解法堿解RNARNA，然后末端轉(zhuǎn)移法，然后末端轉(zhuǎn)移法在在33加上加上polyGpolyGpolyTpolyT- -限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶3GGGGG3GGGGG5 5- -限制性內(nèi)切酶

20、限制性內(nèi)切酶-CCCC-CCCCDNApolDNApolpolyTpolyT- -限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶3GGGGG3GGGGG5 5- -限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶-CCCC-CCCC5 53 3酶切并克隆到表達(dá)載體酶切并克隆到表達(dá)載體篩選重組體并在體外進(jìn)行表達(dá)篩選重組體并在體外進(jìn)行表達(dá)* *引導(dǎo)法合成引導(dǎo)法合成cDNAcDNAmRNAmRNA外加引物合成法4、cDNA cloning： 質(zhì)粒載體： pUC （表達(dá)），pBR322 噬菌體DNA：gt11（表達(dá)） gt10 插入片段大于10Kb選噬菌體，小于10Kb選質(zhì)粒 1質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒 質(zhì)粒質(zhì)粒pBR322是經(jīng)人工構(gòu)建的一種較為理想

21、的大腸是經(jīng)人工構(gòu)建的一種較為理想的大腸桿菌質(zhì)粒載體，亦是應(yīng)用最為廣泛的克隆載體，利桿菌質(zhì)粒載體，亦是應(yīng)用最為廣泛的克隆載體，利用用pBR322曾克隆到多種基因，雖然現(xiàn)在已有多種曾克隆到多種基因，雖然現(xiàn)在已有多種具有更優(yōu)良特性的新型克隆載體逐漸代替了具有更優(yōu)良特性的新型克隆載體逐漸代替了pBR322在基因克隆中地位，但在基因克隆中地位，但pBR322仍是人工仍是人工構(gòu)建的具有幾乎所有的理想特性的基因克隆載體之構(gòu)建的具有幾乎所有的理想特性的基因克隆載體之一。一。pBR322質(zhì)粒是按照標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒載體命名法則質(zhì)粒是按照標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒載體命名法則命名的。命名的?！皃”表示它是一種質(zhì)粒；而表示它是一種質(zhì)粒；而

22、“BR”則是分則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者FBo1ivar和和RLRodriguez姓氏的頭一個(gè)字母，姓氏的頭一個(gè)字母，“322系系指實(shí)驗(yàn)室編號(hào)，以與其他質(zhì)粒載體如指實(shí)驗(yàn)室編號(hào)，以與其他質(zhì)粒載體如pBR325，pBR327，pBR328等相區(qū)別。等相區(qū)別。 四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r) )(ter(terr r) )第一部分：來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基 因（ampr）；第二部分：來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（

23、tetr）；第三部分：來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）1、第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是具有較小的分子量 2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào) 3、具較高的拷貝數(shù) pUC載體是在載體是在pBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5，端端帶有一段多克隆位點(diǎn)的帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。特性的新型質(zhì)粒載體系列。（1）來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ori)；（2）氨芐青霉素抗性基因(ampr)，但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶

24、的單識(shí)別位點(diǎn)；(3) 大腸桿菌-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因；（4）位于lacZ基因中的靠近5”端的一段多克隆位點(diǎn)(MCS ，multiple cloning sites)區(qū)，但它并不破壞該基因的功能(圖)。 與pBR322質(zhì)粒載體相比，pUC質(zhì)粒載體系列具有許多方面的優(yōu)越性，是目前基因工程研究中最通用的大腸桿菌克隆載體之一。其優(yōu)點(diǎn)概括起來(lái)有如下三個(gè)方面： 第一、 具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù) 第二，適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體 第三，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū) AmproripUC18(3 kb)MCS (Multiple cloning

25、 sites,多克隆位點(diǎn)）Lac promoterlacZACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA. T h rA s n S er S e r Val Pro Gly Asp Pro Leu Glu Ser Thr Cys Arg His Ala SerEcoRI SacI KpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIHincIIAccIPstISphILac Z1. The ORF of the inserted gene has to be in the same direction as that of the

26、lacZ 2. A fusion protein contains the N-terminal sequence of lacZ and the inserted ORF will be produced 插入型載體:只具有一個(gè)限制酶位點(diǎn)可便于外源DNA插入的載體.gt10、 gt11 用于克隆10kb的外源DNA，cDNA及小片段DNA 取代型載體:含有二個(gè)限制酶切點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源DNA片段所取代的載體。 EMBL 克隆真核生物染色體DNA 隨著體外包裝技術(shù)和寡聚核苷酸合成技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)構(gòu)建了許多帶有多克隆位點(diǎn)的噬菌體載體，現(xiàn)在常規(guī)使用的噬菌體載體，不少既可用

27、作插入型又可用作置換型?？傊嗫寺∥稽c(diǎn)的引入不僅極大地?cái)U(kuò)展了噬菌體的克隆范圍，同時(shí)還大大地簡(jiǎn)化了其操作技術(shù)。 5、將重組體導(dǎo)入、將重組體導(dǎo)入host cell6、cDNA library identification 7、目的、目的cDNA 克隆的分離和鑒定克隆的分離和鑒定 （限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測(cè)（限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測(cè)序、確定基因的序、確定基因的 轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)等。）轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)等。）cDNAcDNA文庫(kù)的篩選文庫(kù)的篩選 同源探針：同源探針： - - 表達(dá)基因差異顯示技術(shù)設(shè)計(jì)的探針：表達(dá)基因差異顯示技術(shù)設(shè)計(jì)的探針：DDRT-PCRDDRT-PCR 反向引物為反向引物為5 5-oligo(dT)MN-3-oligo(dT)MN-3引物（引物（M, M, dA/dG/dCdA/dG/dC； N, N, dA/dG/dT/dCdA/dG/dT/dC正向引物為隨即核甘酸正向引物為隨即核甘酸序列序列 - - 利用已知基因的同源序列設(shè)計(jì)的探針：利用已知基因的同源序列設(shè)計(jì)的探針： 特異性抗體篩選特異性抗體篩選 噬菌體表面展示技術(shù)噬菌體表面展示技術(shù) 酵母雙