基因工程載體質(zhì)粒

1、2021/3/101基基 因因 工工 程程 載體載體 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 陳 溥 言2021/3/102 概概 述述 基因工程是利用酶學(xué)方法將不同來源的基因工程是利用酶學(xué)方法將不同來源的DNA或或cDNA，在體外切割、修飾、連接插，在體外切割、修飾、連接插入到不同目的的基因工程載體中，進行擴入到不同目的的基因工程載體中，進行擴增和表達，研究基因結(jié)構(gòu)和功能，基因和增和表達，研究基因結(jié)構(gòu)和功能，基因和蛋白質(zhì)關(guān)系的一種分子生物學(xué)技術(shù)。蛋白質(zhì)關(guān)系的一種分子生物學(xué)技術(shù)。2021/3/103 載體 基因工程的十分重要的工具。載體DNA分子中是有一段生長擴增的非必需區(qū)，該區(qū)經(jīng)人工改造后可插入外源的DNA

2、，并可送入宿主細(xì)胞中，使外源DNA與載體DNA重組并共同擴增。2021/3/104 目前的載體主要有目前的載體主要有： 1,質(zhì)粒（質(zhì)粒（Plasmid）載體）載體2,入噬菌體入噬菌體3,柯斯質(zhì)粒（柯斯質(zhì)粒（Cosmid）4,M13噬菌體噬菌體5,雜交質(zhì)粒雜交質(zhì)粒6,病毒載體，包括穿梭載體（病毒載體，包括穿梭載體（Shuttle ）。）。7,細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體.(bacterial artificial chromosome，Shizuya，1992 BAC)8,酵母人工染色體酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，Merry，1983 YAC)9,來源

3、于來源于P1的細(xì)菌人工染色體（的細(xì)菌人工染色體（P1-derived artificial chromosome PAC, loannon，1994）、）、10,哺乳動物人工染色體（哺乳動物人工染色體（MAC，mamal artificial chromosome，F(xiàn)arr，1991）11,人類人工染色體（人類人工染色體（HAC，human artificial chromosome，Harrington,1997）12,植物人工染色體植物人工染色體(PAC) 2021/3/105質(zhì) 粒 載 體（Plasmid） 一詞最早是由一詞最早是由Lederberg，1952年提出的。年提出的。是雙鏈、

4、閉環(huán)是雙鏈、閉環(huán)DNA復(fù)制子（復(fù)制子（replicon）, ,存在于存在于細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中并獨立于染色體之外細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中并獨立于染色體之外, ,能自主復(fù)能自主復(fù)制的一類制的一類DNA。 酵母的殺傷質(zhì)粒（酵母的殺傷質(zhì)粒（Killer Plasmid）是例外）是例外, ,它是一種它是一種RNA復(fù)制子。根據(jù)復(fù)制子。根據(jù)導(dǎo)鏈霉菌中存在導(dǎo)鏈霉菌中存在 線狀質(zhì)粒線狀質(zhì)粒 。質(zhì)粒是細(xì)菌復(fù)制。質(zhì)粒是細(xì)菌復(fù)制所非必須的，也就是說細(xì)菌失去質(zhì)粒后仍可正常所非必須的，也就是說細(xì)菌失去質(zhì)粒后仍可正常生長繁殖。但質(zhì)粒可以賦于寄主某種新的有利的生長繁殖。但質(zhì)?？梢再x于寄主某種新的有利的表型表型。 2021/3/106 質(zhì)粒

5、載體質(zhì)粒載體l 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的一般特點：的一般特點： 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA可在宿主菌中自主復(fù)制，又是細(xì)菌復(fù)制非必須的?？稍谒拗骶凶灾鲝?fù)制，又是細(xì)菌復(fù)制非必須的。 占總的基因組的占總的基因組的13%。 所有原核生物都有質(zhì)粒。所有原核生物都有質(zhì)粒。 賦于細(xì)菌一種表型，是菌株特性不是菌種特性。賦于細(xì)菌一種表型，是菌株特性不是菌種特性。 隱蔽質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒(Cryptic plasmid)。 質(zhì)粒都是雙鏈閉環(huán)質(zhì)粒都是雙鏈閉環(huán)DNA復(fù)制子，酵母的殺傷質(zhì)粒例外復(fù)制子，酵母的殺傷質(zhì)粒例外(RNA)。 2021/3/107質(zhì)粒的一般生物學(xué)性質(zhì)質(zhì)粒的一般生物學(xué)性質(zhì) 1969年年Rownd提出嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒和松

6、馳型控制的質(zhì)粒。主提出嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒和松馳型控制的質(zhì)粒。主要指在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基生長條件下，每個細(xì)菌中所含的質(zhì)粒要指在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基生長條件下，每個細(xì)菌中所含的質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)的拷貝數(shù)多少劃分的。多少劃分的。嚴(yán)緊型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒，一般分子量較高；每個寄主細(xì)胞中僅含，一般分子量較高；每個寄主細(xì)胞中僅含1060個拷貝的質(zhì)粒；個拷貝的質(zhì)粒；松馳型質(zhì)粒松馳型質(zhì)粒,每個細(xì)菌中所含的質(zhì)粒每個細(xì)菌中所含的質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)高的拷貝數(shù)高,一種質(zhì)一種質(zhì)粒究竟屬于嚴(yán)緊型還是松馳型并不是絕對的。往往與寄主狀況有關(guān)。質(zhì)粒的復(fù)粒究竟屬于嚴(yán)緊型還是松馳型并不是絕對的。往往與寄主狀況有關(guān)。質(zhì)粒的復(fù)制不僅受自身的制約，而且

7、還受寄主菌的控制。制不僅受自身的制約，而且還受寄主菌的控制。氯霉素是蛋白質(zhì)合成的抑制氯霉素是蛋白質(zhì)合成的抑制劑，一般在細(xì)菌生長的對數(shù)生長期后期劑，一般在細(xì)菌生長的對數(shù)生長期后期(細(xì)菌達細(xì)菌達1109細(xì)胞細(xì)胞/mL)，加入氯，加入氯霉素或壯觀霉素，細(xì)菌染色體和嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松馳型質(zhì)粒經(jīng)霉素或壯觀霉素，細(xì)菌染色體和嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松馳型質(zhì)粒經(jīng)過過1012小時，每個細(xì)胞中可多達幾百個，甚至幾千個質(zhì)粒。每個細(xì)胞中小時，每個細(xì)胞中可多達幾百個，甚至幾千個質(zhì)粒。每個細(xì)胞中可達可達50%以上以上DNA是質(zhì)粒是質(zhì)粒DNA。嚴(yán)緊型嚴(yán)緊型(Stringent plasmid)和松馳型和松馳型(rel

8、axed plasmid)質(zhì)粒質(zhì)粒2021/3/108 PUC質(zhì)粒都屬松馳型質(zhì)粒。質(zhì)粒都屬松馳型質(zhì)粒。 PACYC184等質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型質(zhì)粒。等質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型質(zhì)粒。 根據(jù)需要使用嚴(yán)緊型還是松馳型質(zhì)粒根據(jù)需要使用嚴(yán)緊型還是松馳型質(zhì)粒,如如果插入外源果插入外源DNA較大較大,或其產(chǎn)量過高會產(chǎn)或其產(chǎn)量過高會產(chǎn)生對宿主菌新陳代謝有干擾作用時，常生對宿主菌新陳代謝有干擾作用時，常選用嚴(yán)緊型質(zhì)粒。反之選用松馳型質(zhì)粒。選用嚴(yán)緊型質(zhì)粒。反之選用松馳型質(zhì)粒。2021/3/1092. 質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性(incompatibility) 利用同一復(fù)制系統(tǒng)不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定的和平共處的利用同一復(fù)制系統(tǒng)不同質(zhì)粒不

9、能穩(wěn)定的和平共處的生存，稱為質(zhì)粒的不相容性，有時又稱不親和性，是指生存，稱為質(zhì)粒的不相容性，有時又稱不親和性，是指在沒有選擇壓力情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，在沒有選擇壓力情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一寄主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存現(xiàn)象。在細(xì)菌增殖不能夠在同一寄主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存現(xiàn)象。在細(xì)菌增殖過程中，其中一種質(zhì)粒必然會丟失。分子克隆技術(shù)正基過程中，其中一種質(zhì)粒必然會丟失。分子克隆技術(shù)正基于質(zhì)粒的不相容性質(zhì)，在只帶有一種質(zhì)粒的細(xì)菌中，提于質(zhì)粒的不相容性質(zhì)，在只帶有一種質(zhì)粒的細(xì)菌中，提取單一的取單一的DNA。2021/3/10103. 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 革蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)粒

10、分為接合型質(zhì)粒革蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)粒分為接合型質(zhì)粒(Conjugative plasmid)，又叫自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。它們既具有自我復(fù)制遺傳，又叫自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。它們既具有自我復(fù)制遺傳信息，又具有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。信息，又具有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。接合型質(zhì)粒多屬于嚴(yán)緊型質(zhì)粒。接合型質(zhì)粒多屬于嚴(yán)緊型質(zhì)粒。 非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒(non-conjugative plasmid)也叫不能自我也叫不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。因為它們僅僅帶有自主復(fù)制的遺傳信息。非轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。因為它們僅僅帶有自主復(fù)制的遺傳信息。非接合型質(zhì)粒多屬于松馳型質(zhì)粒。接合型質(zhì)粒多屬于松馳型質(zhì)粒。1）質(zhì)粒的類型

11、）質(zhì)粒的類型2021/3/1011 非接合型質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中同時存在非接合型質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中同時存在一種接合型質(zhì)粒，那么它們通常也是一種接合型質(zhì)粒，那么它們通常也是可以被轉(zhuǎn)移的。這種由共存的接合型可以被轉(zhuǎn)移的。這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫質(zhì)粒的遷移作用（叫質(zhì)粒的遷移作用（mobiligation）又叫質(zhì)粒的誘動。又叫質(zhì)粒的誘動。 2021/3/1012帶有大腸桿菌素基因的帶有大腸桿菌素基因的Col質(zhì)粒和帶有抗菌素抗性基因的質(zhì)粒和帶有抗菌素抗性基因的R質(zhì)粒既有屬于接合型的，也有屬于非接合型的。質(zhì)粒既有屬于接合型的，也有屬于非接合型的。

12、如果在非接合型質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中同時存在一種接合如果在非接合型質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中同時存在一種接合型質(zhì)粒，那么它們通常也是可以被轉(zhuǎn)移的。這種由共存的型質(zhì)粒，那么它們通常也是可以被轉(zhuǎn)移的。這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫質(zhì)粒的遷接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫質(zhì)粒的遷移作用移作用(mobilization)又叫質(zhì)粒的誘動。又叫質(zhì)粒的誘動。ColE1是一種可以是一種可以遷移但屬于非接合型質(zhì)粒。遷移但屬于非接合型質(zhì)粒。2021/3/10132）F 因子因子 F因子是最有代表性的接合型質(zhì)粒，又稱致育因子因子是最有代表性的接合型質(zhì)粒，又稱致育因子(fertility facto

13、r)或性質(zhì)?；蛐再|(zhì)粒(Sex plasmid)。它在寄主細(xì)胞中有。它在寄主細(xì)胞中有三種存在方式：三種存在方式：獨立于染色體之外，閉環(huán)雙鏈獨立于染色體之外，閉環(huán)雙鏈DNA形式形式存在。這種細(xì)胞稱存在。這種細(xì)胞稱F+細(xì)胞。細(xì)胞。獨立于染色體之外，閉環(huán)雙獨立于染色體之外，閉環(huán)雙鏈鏈DNA形式存在，但其形式存在，但其DNA上還攜帶有寄主菌染色體基因上還攜帶有寄主菌染色體基因或或DNA區(qū)段。這種細(xì)胞稱之為區(qū)段。這種細(xì)胞稱之為F-細(xì)胞。細(xì)胞。以線性以線性DNA形式，形式，從不同位點整合到寄主菌染色體上，這種細(xì)胞稱為從不同位點整合到寄主菌染色體上，這種細(xì)胞稱為Hfr細(xì)胞細(xì)胞(高頻重組細(xì)胞高頻重組細(xì)胞)。 2

14、021/3/1014 F因子是雄性決定因子，因子是雄性決定因子，F(xiàn)+細(xì)胞表面可以形細(xì)胞表面可以形成一種叫做性須（成一種叫做性須（pilus）的結(jié)果，它促使）的結(jié)果，它促使F+經(jīng)性須進入經(jīng)性須進入F-細(xì)胞。細(xì)胞。F-細(xì)胞則變?yōu)榧?xì)胞則變?yōu)镕+細(xì)胞。細(xì)胞。F因子可以通過接合作用自我轉(zhuǎn)移，也能夠因子可以通過接合作用自我轉(zhuǎn)移，也能夠帶動寄主染色體一道轉(zhuǎn)移。但帶動寄主染色體一道轉(zhuǎn)移。但F因子的這種因子的這種整合過程是可逆的。在一定條件下，整合過程是可逆的。在一定條件下，Hfr細(xì)細(xì)胞又可重新變?yōu)榘挚芍匦伦優(yōu)镕+或或F-細(xì)胞。細(xì)胞。 基因工程多選用非接合型質(zhì)粒，主要安全基因工程多選用非接合型質(zhì)粒，主要安全角

15、度考慮角度考慮 2021/3/1015人工質(zhì)粒要素人工質(zhì)粒要素1質(zhì)粒的基因組小好（不影響生物學(xué)功能前題）質(zhì)粒的基因組小好（不影響生物學(xué)功能前題）。轉(zhuǎn)化入細(xì)菌的轉(zhuǎn)化率與質(zhì)粒大小呈反比，當(dāng)質(zhì)。轉(zhuǎn)化入細(xì)菌的轉(zhuǎn)化率與質(zhì)粒大小呈反比，當(dāng)質(zhì)粒大于粒大于15kb時，轉(zhuǎn)化率將成為限制因素時，轉(zhuǎn)化率將成為限制因素,質(zhì)粒大，質(zhì)粒大，拷貝數(shù)越低?？截悢?shù)越低。2質(zhì)粒應(yīng)易于轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒應(yīng)易于轉(zhuǎn)化。3質(zhì)粒應(yīng)有較多的拷貝數(shù)。質(zhì)粒應(yīng)有較多的拷貝數(shù)。4選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記。5質(zhì)粒質(zhì)粒DNA可插入可插入結(jié)合較大的外源結(jié)合較大的外源DNA。 2021/3/1016大腸桿菌質(zhì)粒分子的結(jié)構(gòu)示意圖大腸桿菌質(zhì)粒分子的結(jié)構(gòu)示意圖環(huán)形染色體環(huán)形染

16、色體DNADNA環(huán)形環(huán)形質(zhì)粒分子質(zhì)粒分子大腸桿菌細(xì)胞大腸桿菌細(xì)胞抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因控制控制質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA轉(zhuǎn)移的基因轉(zhuǎn)移的基因質(zhì)粒質(zhì)粒DNA2021/3/1017質(zhì)粒主要包括幾個組成部分質(zhì)粒主要包括幾個組成部分 復(fù)制子（復(fù)制子（reilcator） 復(fù)制起始位點復(fù)制起始位點(replication origin site) 多克隆位點（多克隆位點（Polylink）(MCS) 輔助序列輔助序列(COS位點等位點等) 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記(LacZ,抗性等抗性等)2021/3/10182021/3/1019pUC 18 和pUC 19質(zhì)粒圖譜2021/3/10202021/3/1021

17、2021/3/1022 質(zhì)粒主要包括幾個組成部分：質(zhì)粒主要包括幾個組成部分： 一、復(fù)制子（一、復(fù)制子（reilcator） 也就是基礎(chǔ)復(fù)制子（也就是基礎(chǔ)復(fù)制子（basic replicon），），具有原質(zhì)粒同樣拷貝數(shù)的最小自主復(fù)制具有原質(zhì)粒同樣拷貝數(shù)的最小自主復(fù)制單位。一般約單位。一般約2kb，含一個復(fù)制起始部，含一個復(fù)制起始部位位Orgin（Ori）拷貝數(shù)）拷貝數(shù)多少多少和攜帶有和攜帶有控制復(fù)制的基因信息?？刂茝?fù)制的基因信息。2021/3/1023 復(fù)制起始位點復(fù)制起始位點(replication origin site) 是富是富 含含A, T區(qū)區(qū),雙鏈雙鏈DNA在此在此 解鏈出現(xiàn)復(fù)制叉解

18、鏈出現(xiàn)復(fù)制叉.緊靠緊靠 富富 A, T區(qū)的側(cè)面富區(qū)的側(cè)面富G,C區(qū)區(qū),組成回文結(jié)構(gòu)組成回文結(jié)構(gòu),是是參與復(fù)制相關(guān)因子識別和結(jié)合位點參與復(fù)制相關(guān)因子識別和結(jié)合位點.2021/3/1024 具備有多克隆位點（具備有多克隆位點（Polylink）(MCS) 有數(shù)種限制性內(nèi)切酶有數(shù)種限制性內(nèi)切酶單一識別位點單一識別位點。便。便于插入外源于插入外源DNA片段，易組建重組質(zhì)粒片段，易組建重組質(zhì)粒而不影響質(zhì)粒復(fù)制功能而不影響質(zhì)粒復(fù)制功能 2021/3/1025 有多用途的輔助序列有多用途的輔助序列 如加入不同啟動子序列，用于生產(chǎn)單鏈如加入不同啟動子序列，用于生產(chǎn)單鏈DNA或或RNA，外源基因的大量表達。又，

19、外源基因的大量表達。又加入加入COS位點，使載體能容納更大的位點，使載體能容納更大的DNA片段等等。片段等等。 2021/3/1026 質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記： 外源DNA片段與質(zhì)粒載體DNA連接，再轉(zhuǎn)化入宿主菌，經(jīng)培養(yǎng)后需篩選鑒定轉(zhuǎn)化子。這就需要利用質(zhì)粒載體的可選擇標(biāo)記。 2021/3/1027 質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記 最常用，主要有：四環(huán)素最常用，主要有：四環(huán)素(Tet)、氨芐青霉素、氨芐青霉素(Amp)、氯霉素、氯霉素(Cm)、卡、卡那霉素那霉素(Kan)、新霉素、新霉素(Neo)等。如質(zhì)粒對氨芐青霉素有抗生時，則寫成等。如質(zhì)粒對氨芐青霉素有抗生時，則寫成Ampr，反之則寫成，

20、反之則寫成Amps。帶有抗藥性質(zhì)粒稱為。帶有抗藥性質(zhì)粒稱為R質(zhì)粒。一個質(zhì)粒載體通質(zhì)粒。一個質(zhì)粒載體通常有二種抗生素抗性基因，這樣篩選質(zhì)粒載體更可靠。外源常有二種抗生素抗性基因，這樣篩選質(zhì)粒載體更可靠。外源DNA片段插入片段插入鈍化了一個抗性基因，保留了另一個抗性基因。插入失活型載體，就是將鈍化了一個抗性基因，保留了另一個抗性基因。插入失活型載體，就是將外源外源DNA片段插入到會導(dǎo)致選擇性基因片段插入到會導(dǎo)致選擇性基因(Ampr，Tetr等等)失活的位點。如失活的位點。如PACYC184質(zhì)粒的質(zhì)粒的EcoRI上插入外源上插入外源DNA片段，會導(dǎo)致氯霉素抗生基因失活片段，會導(dǎo)致氯霉素抗生基因失活(

21、Cms)。也有例外，如。也有例外，如Villa-Komaroff等等1978年發(fā)現(xiàn)鼠胰島素年發(fā)現(xiàn)鼠胰島素cDNA片段插片段插入入PstI切點，并未使切點，并未使Ampr基因失活?；蚴Щ?。 抗生素抗性基因選擇標(biāo)記抗生素抗性基因選擇標(biāo)記2021/3/1028 常用的是抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記。主要有：四環(huán)素（Ter），氨芐青霉素（Amp），氯霉素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo）等。如質(zhì)粒對氨芐青霉素有抗生時，則寫成AmPr，反之則寫成AmPs，。帶有抗藥性質(zhì)粒稱為R質(zhì)粒。一個質(zhì)粒載體通常有二種抗生素抗性基因 2021/3/1029 新的質(zhì)粒還帶有下列標(biāo)記基因，使于篩選重組體： HA

22、Luaferase GFP 便于檢測的多肽2021/3/1030原理是具有四環(huán)素抗性的細(xì)菌對親脂的螯合劑萎蔫酸原理是具有四環(huán)素抗性的細(xì)菌對親脂的螯合劑萎蔫酸(fusaric acid)極為敏感，因此，將外源性極為敏感，因此，將外源性DNA插入到質(zhì)粒插入到質(zhì)粒載體的四環(huán)素抗性基因的酶切位點上，在含有萎蔫酸的培載體的四環(huán)素抗性基因的酶切位點上，在含有萎蔫酸的培養(yǎng)基上篩選對四環(huán)素敏感的重組子，則是十分方便的方法。養(yǎng)基上篩選對四環(huán)素敏感的重組子，則是十分方便的方法。丟失四環(huán)素抗性標(biāo)記的正選擇體系丟失四環(huán)素抗性標(biāo)記的正選擇體系2021/3/1031 四環(huán)素抗菌機理是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，使細(xì)菌停四環(huán)素抗菌

23、機理是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，使細(xì)菌停止生長，但菌不死亡。環(huán)絲氨酸是氨基酸的類似物，在止生長，但菌不死亡。環(huán)絲氨酸是氨基酸的類似物，在細(xì)菌的生長過程中，如加入環(huán)絲氨酸，則會參入到細(xì)菌細(xì)菌的生長過程中，如加入環(huán)絲氨酸，則會參入到細(xì)菌新合成的蛋白質(zhì)多肽鏈，使細(xì)菌死亡。所以在含有四環(huán)新合成的蛋白質(zhì)多肽鏈，使細(xì)菌死亡。所以在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上，環(huán)絲氨酸只殺死素培養(yǎng)基上，環(huán)絲氨酸只殺死Tetr 細(xì)菌。對停止生長的細(xì)菌。對停止生長的 Tets 菌則無致死作用。若經(jīng)過環(huán)絲氨酸法多次重復(fù)處理菌則無致死作用。若經(jīng)過環(huán)絲氨酸法多次重復(fù)處理 Tets 菌會富集，產(chǎn)量上可高出數(shù)倍，便于篩選重組子。菌會富集，產(chǎn)量上可高出數(shù)

24、倍，便于篩選重組子。 環(huán)絲氨酸富集法篩環(huán)絲氨酸富集法篩Tets重組子重組子2021/3/1032環(huán)絲氨酸富集法示意圖環(huán)絲氨酸富集法示意圖AmpsTets非轉(zhuǎn)化子非轉(zhuǎn)化子AmprTetr轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子(無插入片段無插入片段)AmprTets轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子( 帶插入片段帶插入片段)轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)化混合物氨芐青霉素選擇氨芐青霉素選擇四環(huán)素環(huán)絲氨酸選擇四環(huán)素環(huán)絲氨酸選擇2021/3/1033 通常用通常用互補現(xiàn)象的檢查。很多質(zhì)粒載體互補現(xiàn)象的檢查。很多質(zhì)粒載體DNA都有一段都有一段(來自大腸來自大腸桿菌桿菌DNA)含含半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(LacZ)的調(diào)控序列和該酶基因氨基端的調(diào)控序列和該酶基因氨基

25、端146個氨基酸編碼信息。并在這個編碼區(qū)中加入一個多克隆酶切位點，并不個氨基酸編碼信息。并在這個編碼區(qū)中加入一個多克隆酶切位點，并不破壞閱讀框。而宿主菌有編碼半乳糖苷酶破壞閱讀框。而宿主菌有編碼半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和質(zhì)粒端部分序列，宿主菌和質(zhì)粒編碼片段各自基因都不完整，都沒有酶活性，當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌后就編碼片段各自基因都不完整，都沒有酶活性，當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌后就會產(chǎn)生具有酶活性的蛋白質(zhì)，加入生色底物會產(chǎn)生具有酶活性的蛋白質(zhì)，加入生色底物X-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)后會形成藍色菌落。而插入后會形成藍色菌落。而插入DNA的重組子則破壞了的重組子

26、則破壞了LacZ的的閱讀框，不能使閱讀框，不能使X-gal變藍，而產(chǎn)生白色菌落。這種變藍，而產(chǎn)生白色菌落。這種LacZ基因上缺失近基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體操縱基因區(qū)段的突變體(宿主菌宿主菌)與帶有完整的近操縱基因片段的與帶有完整的近操縱基因片段的-半乳半乳糖苷酶陰性的突變體糖苷酶陰性的突變體(質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體)之間實現(xiàn)互補，這種互補現(xiàn)象稱為之間實現(xiàn)互補，這種互補現(xiàn)象稱為互互補。這樣通過明顯的顏色變化，挑選重組子則變得簡單易行。往往在這補。這樣通過明顯的顏色變化，挑選重組子則變得簡單易行。往往在這過程中還要加入過程中還要加入IPTG(異丙基硫化異丙基硫化-D-半乳糖苷半乳糖苷)作為酶反應(yīng)

27、催化劑。作為酶反應(yīng)催化劑。4. 顯色法篩選重組子顯色法篩選重組子2021/3/1034 質(zhì)粒DNA有一段（來自大腸桿菌DNA）含半乳糖苷酶基因（Lac Z）的調(diào)控序列和該酶基因氨基端146個氨基酸編碼信息。在這個編碼區(qū)中加入一個多克隆酶切位點，不破壞閱讀框。宿主菌有編碼半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和質(zhì)粒編碼片段各自基因都不完整，都沒有酶活性，當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌后就會產(chǎn)生具有酶活性的蛋白質(zhì)，加入生色底物Xgal后會形成藍色菌落。而插入DNA的重組子則破壞了Lac Z的閱讀框，不能使Xgal變蘭，而產(chǎn)生白色菌落。這種突變體（宿主菌）與質(zhì)粒載體之間互補現(xiàn)象稱為互補。入IPTG作為酶反應(yīng)催化劑。20

28、21/3/1035 通過顏色變化篩選重組子。通常用互補現(xiàn)象的檢查 互補原理互補原理:質(zhì)粒的Lac Z僅編碼-半乳糖苷酶的氨基端宿主菌的Lac Z僅編碼-半乳糖苷酶的羧基端均無活性各自編碼的肽鏈可以融為一體，形成具有酶活性的蛋白。各自編碼的肽鏈可以融為一體，形成具有酶活性的蛋白。5-嗅-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷（X-gal)藍色產(chǎn)物藍色產(chǎn)物-半乳糖苷酶異丙基硫代-D-半乳糖苷 （IPTG)藍藍-白斑實驗白斑實驗2021/3/10362021/3/1037 構(gòu)建的質(zhì)粒人工載體，應(yīng)用最廣的是構(gòu)建的質(zhì)粒人工載體，應(yīng)用最廣的是PBR322，分子量為，分子量為2.6106，含，含46332bp。含有

29、選擇標(biāo)記抗氨芐青霉素。含有選擇標(biāo)記抗氨芐青霉素（Apr r）基因來自天然質(zhì)粒）基因來自天然質(zhì)粒RSF2124和抗和抗四環(huán)素（四環(huán)素（Ter r）基因來自）基因來自PSC101質(zhì)粒。質(zhì)粒。復(fù)制子部分來自復(fù)制子部分來自PMB9（一類（一類Co1E1質(zhì)質(zhì)粒）。多克隆限制性內(nèi)節(jié)切酶位點有粒）。多克隆限制性內(nèi)節(jié)切酶位點有9個個 2021/3/10382021/3/1039 在PBR322的基礎(chǔ)上已構(gòu)建出第二代，第三代質(zhì)粒載體衍生物。PUC系列，Pbluescript質(zhì)粒，體積更小，具有更多的單一限制性內(nèi)切酶位點，其拷貝數(shù)也比PBR322多1020倍。可獲得更多的DNA產(chǎn)量。 2021/3/1040202

30、1/3/1041 質(zhì)粒的消除質(zhì)粒的消除 有的質(zhì)粒在自然條件下可以從宿主菌中有的質(zhì)粒在自然條件下可以從宿主菌中消失。也可以在培養(yǎng)細(xì)菌時加入適當(dāng)?shù)南?。也可以在培養(yǎng)細(xì)菌時加入適當(dāng)?shù)睦砘蛩厥官|(zhì)粒消除（理化因素使質(zhì)粒消除（curing）。）。 質(zhì)粒的消除劑有：吖啶橙，溴化乙錠，質(zhì)粒的消除劑有：吖啶橙，溴化乙錠，利福平，利福平，SDS，紫外線，高溫等。，紫外線，高溫等。2021/3/1042不同載體的用途不盡相同：不同載體的用途不盡相同：1）克隆、擴增外源基因）克隆、擴增外源基因(片段大小片段大小)：質(zhì)粒用于常規(guī)：質(zhì)粒用于常規(guī)DNA克隆?？寺　OSmid和和噬菌體用于染色體，大的噬菌體用于染色體，大

31、的DNA片段克片段克隆。隆。2）外源）外源DNA或或cDNA在載體上進行改造、缺失、重組一在載體上進行改造、缺失、重組一般用質(zhì)粒。般用質(zhì)粒。3）序列分析：）序列分析：dsDNA或或ssDNA測序，用質(zhì)?；驕y序，用質(zhì)?；騇13以及以及一些新型質(zhì)粒。一些新型質(zhì)粒。4）制備探針：單鏈）制備探針：單鏈DNA或或RNA利用質(zhì)粒，制各單鏈利用質(zhì)粒，制各單鏈DNA探針利用探針利用M13。5）表達原核基因的載體：質(zhì)粒，入噬菌體）表達原核基因的載體：質(zhì)粒，入噬菌體(表呈技術(shù)表呈技術(shù))2021/3/10436）表達真核基因載體）表達真核基因載體(包括病毒疫苗研制包括病毒疫苗研制)：質(zhì)粒、酵母、：質(zhì)粒、酵母、病毒病

32、毒7）轉(zhuǎn)移載體：將外源基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞中，建立）轉(zhuǎn)移載體：將外源基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞中，建立穩(wěn)定表達基因的細(xì)胞株，常用質(zhì)粒和病毒載體。穩(wěn)定表達基因的細(xì)胞株，常用質(zhì)粒和病毒載體。8）PCR產(chǎn)物克隆載體：產(chǎn)物克隆載體：T載體、載體、Teasy載體、載體、PCR等。等。9）DNA疫苗載體疫苗載體10）研究基因結(jié)構(gòu)功能的載體，如無啟動子載體。）研究基因結(jié)構(gòu)功能的載體，如無啟動子載體。2021/3/1044 載體如何選擇：載體如何選擇： 1根據(jù)插入片段大小，及酶切位點。根據(jù)插入片段大小，及酶切位點。 2重組體的目的、作用（文庫、表重組體的目的、作用（文庫、表達、基因調(diào)控、探針、突變）。達、基因調(diào)控、

33、探針、突變）。 3篩選方便（探針、免疫學(xué)方法、篩選方便（探針、免疫學(xué)方法、抗性、顯色）。抗性、顯色）。 4便于提純（加入便于提純（加入His、生物學(xué)、生物學(xué) 、牛血清血蛋白牛血清血蛋白BSA）。）。 不同載體用途不盡相同不同載體用途不盡相同2021/3/1045 一一、克隆、擴增外源基因（片段大?。┛寺?、擴增外源基因（片段大小） 質(zhì)粒用于常規(guī)質(zhì)粒用于常規(guī)DNA克隆?？寺?。COSmid和入和入噬 菌 體噬 菌 體 , 細(xì) 菌 人 工 染 色 體細(xì) 菌 人 工 染 色 體.酵母人工染色體酵母人工染色體,用于染色體，大的用于染色體，大的DNA片片段克隆。段克隆。2021/3/1046 二二、外源、外源DNA或或CDNA在載體上進行改造、缺在載體上進行改造、缺失、重組一般用質(zhì)粒。失、重組一般用質(zhì)粒。 三三、序列分析、序列分析 dsDNA或或ssDNA測序，用質(zhì)粒或測序，用質(zhì)?；騇13以及一些以及一些新型質(zhì)粒。新型質(zhì)粒。 四四、制備探針、制備探針 單鏈單鏈DNA或或RNA利用質(zhì)粒，制各單鏈利用質(zhì)粒，制各單鏈D