反相高效液相色譜測定動物源食品中大觀霉素殘留

1、反相高效液相色譜測定動物源食品中大觀霉素殘留 作者：苑麗 胡功政 肖傳斌 梁軍 李奎 司紅彬【摘要】 目的 建立反相高效液相色譜法配合電化學檢測器測定動物源食品中大觀霉素殘留。方法 用三氯乙酸勻漿抽提以脫去試樣中的蛋白，然后用二氯甲烷去除試樣中的脂溶性物質，再經(jīng)LC?SCX陽離子固相萃取小柱凈化處理，產(chǎn)物進行檢測。流動相為離子對緩沖體系(0.02mol/L檸檬酸0.004mol/L庚烷磺酸鈉，50% NaOH調pH至6.10)乙腈(體積比為92.57.5)，流速0.6ml/min，工作電極電壓1.0V，柱溫35，檢測波長254nm。結果 大觀霉素在0.0110.0g/ml范圍內線性關系良好，相

2、關系數(shù)R=0.99998。結論 該法簡便、直接、準確。 【關鍵詞】 反相高效液相色譜 電化學檢測器 大觀霉素 殘留 Determination of spectinomycin residues in animal food by RP?HPLC ABSTRACT Objective A reversed?phase high performance liquid chromatography (RP?HPLC) method with electrochemical detector was established for the determination of spectinomycin

3、 residues in animal food.Methods The samples were deproteinized by trichloroacetic acid, and the fatty soluble substances were extracted with dichloromethane. Followed by cleaned?up on a LC?SCX positive ion solid?phase extraction column, then the extracts were determined. The mobile phase was citric

4、 acid ion?pair buffer solution (0.02mol/L citric acid0.004mol/L sodium heptanesulfonate, the pH adjusted to 6.10 by 50% NaOH)acetonitrile (92.57.5, V/V). The flow rate was 0.6ml/min, the working electrode voltage was 1.0V, the column temperature was maintained at 35, and the detection wavelength was

5、 at UV 254nm. Results The linear relationship of the peak and concentration of spectinomycin was determined as 0.0110.0g/ml, with a regression coefficient of 0.99998. Conclusions The method is simple, direct,and accurate. KEY WORDS RP?HPLC; Electrochemical detector; Spectinomycin; Residues 大觀霉素(spec

6、tinomycin，曾譯壯觀霉素)是氨基糖苷類抗生素，主要通過作用于細菌核糖體30S亞基來抑制其蛋白質的合成，對革蘭陰性菌(如大腸埃希菌、沙門菌、布魯菌、變形菌、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌等)有較強作用，對革蘭陽性菌和支原體亦有一定作用。我國獸藥典獸藥使用指南(化學藥品卷，2005版)1及美國FDA均規(guī)定本品在牛、羊、豬、雞等食用組織中最高允許殘留量分別為：肌肉：500g/kg；脂肪、肝：2000g/kg和腎：5000g/kg。國外一些學者建立了各種HPLC法26來檢測動物源食品中本品的殘留，但大觀霉素無紫外吸收，必須形成紫外可見光或熒光化合物后才能進行HPLC分析7，8，即必須先進行衍化生成相應

7、的衍化物。迄今為止，所有這些方法即缺乏必要的靈敏度，亦有繁雜的衍化過程，難以推廣應用。1994年美國農(nóng)業(yè)部又建立微生物學方法來檢測本品在食品中的殘留，但其靈敏度也低，且缺乏特異性。Elrod等9發(fā)現(xiàn)大觀霉素具有電化學活性，發(fā)展了一種使用離子對色譜電化學檢測器的方法測定大觀霉素，但并未用該法測定生物樣品。Schermerhorn等10報道用帶有電化學檢測器的HPLC來檢測牛奶中的大觀霉素殘留。我國進出口商品檢疫局1997年發(fā)布了出口肉及肉制品中大觀霉素殘留檢測的HPLC電化學法，測定方法靈敏度高，但樣品提取步驟繁雜，不適用于脂肪組織，其凈化過程系用活性炭制柱，處理后的待檢液中的雜質仍干擾測定結果

8、。本方法采用三氯乙酸抽提去除樣品中的蛋白、二氯甲烷去除試樣中脂溶性物質，經(jīng)LC?SCX陽離子固相萃取小柱凈化處理，再用反相高效液相色譜配合電化學檢測器直接檢測動物源食品中殘留的大觀霉素，結果表明，本方法簡單、直接，且回收率、檢測限和準確度均可達到相關標準。 1 儀器和試藥 1.1 儀器 帶515泵、2465電化學檢測器的高效液相色譜儀(美國Waters公司)、電子天平(感量0.0001g)、高速組織搗碎機、回旋式振蕩器、高速冷凍離心機和Supelclean LC?SCX SPE陽離子固相萃取小柱(500mg/3ml，含碳量14%)。 1.2 試藥 大觀霉素為山東魯抗生產(chǎn)，含量不少于99.0%；

9、乙腈(色譜純，Baker公司)，庚烷磺酸鈉(色譜純，Sigma公司)；水為色譜級超純水(采用Millipore公司純水系統(tǒng)自制)；帶一個結晶水的檸檬酸、甲醇、氫氧化鈉、氯化鈉、三氯乙酸和二氯甲烷均為分析純試劑。 2 方法與結果 2.1 色譜條件 色譜柱：C18柱(瑞典AKZO NOBEL Kromasi C18，250mm4.6mm，5m)；保護柱(LabALLianceTM C18)；流動相為檸檬酸離子對緩沖體系(0.2mol/L檸檬酸0.004mol/L庚烷磺酸鈉，50% NaOH調pH至6.10)乙腈(體積比為92.57.5)，流速為0.6ml/min，工作電極電壓1.0V，柱溫35，檢

10、測波長254nm，進樣量20l，分離結果見圖1。 2.2 標準曲線的繪制 準確稱取大觀霉素0.0298g，加水溶解并定容為100ml，配成濃度為200g/ml的儲備液(按有效量計)，置4冰箱中保存，一周內用完。臨用前， 取此儲 圖1 大觀霉素標準溶液的高效液相色譜圖(20g/ml)備液用純水稀釋成0.01、0.02、0.05、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0g/ml濃度的大觀霉素標準溶液，在“2.1”色譜條件下進樣，經(jīng)電化學檢測器檢測，按其所得峰面積與對應的標準液濃度作標準曲線，并計算回歸方程為： A=0.75468+16.53266C R=0.999976 表明大觀霉素在0

11、.0110.0g/ml范圍內線性關系良好。 2.3 樣品處理 2.3.1 抽提 稱取(15g0.05g)試樣，轉至一個50ml的離心管中，加入12ml超純水，在1800r/min條件下用高速組織搗碎機搗1min，取粘稠液18g加50%三氯乙酸2ml和二氯甲烷10ml，在回旋式振蕩器上高速振搖30min。然后在4 3800RCFRCF=0.0000118RN2，R為離心半徑(cm)，N為轉速(r/min)條件下離心30min，取上清10ml，加二氯甲烷2ml，在回旋加速器上振蕩混合20min，再在4 12000RCF條件下離心30min，上清液即為藥物的抽提液。 2.3.2 凈化 采用LC?SC

12、X陽離子固相萃取小柱凈化。首先LC?SCX小柱用甲醛活化，再用純水平衡后，將經(jīng)“2.3.1”法制得的備用液過柱，起始2ml棄去，收集隨后3ml，經(jīng)水性濾膜(0.45m)過濾，濾液供HPLC測定。對肌肉和脂肪內本藥的殘留測定，可取“2.3.1”法制得的抽提液直接過0.45m水性濾膜即可。百事通 2.4 試樣中藥物殘留量計算 經(jīng)“2.3”方法處理過的組織待測試樣在“2.1”色譜條件下進樣，經(jīng)電化學檢測器檢測，空白雞脂肪組織、雞肉組織、雞肝臟組織和雞腎臟組織HPLC雜質峰不干擾加藥(加藥量為最高殘留限量)后試樣的HPLC色譜圖(圖2)，大觀霉素峰依次位于10.43、10.63、10.62和10.54

13、min。將其所得峰面積帶入標準曲線回歸方程，可求出試樣中殘留的藥物濃度或藥物含量。 2.5 靈敏度、回收率和精密度試驗 圖2 加藥雞脂肪組織的高效液相色譜圖(2g/g) 用添加法測定。分別取豬、雞空白肌肉、脂肪、肝、腎組織各15.0g，添加適量的大觀霉素標準溶液，按“2.3”方法處理后在“2.1”色譜條件下進樣，經(jīng)電化學檢測器檢測，將其所得峰面積帶入標準曲線回歸方程，計算大觀霉素含量，以加入量與測得量之比計算回收率。每種組織各測定包括最高殘留限量和靈敏度在內的三種添加濃度，每個濃度各測3批樣品計算批間變異系數(shù)，每批樣品各進行5個重復計算批內變異系數(shù)。 結果表明，豬、雞肌肉、脂肪中本品的檢測限為

14、100g/kg，肝臟、腎臟中的檢測限為200g/kg，均低于最高允許殘留量1。各濃度點回收率均在71.38%94.81%范圍內。本方法的批內變異系數(shù)在4.19%9.86%范圍之內，批間變異系數(shù)在4.86%12.99%范圍之內。 2.6 抗干擾試驗 鑒于大觀霉素在畜禽疾病防治中多與林可霉素復配使用，故進行了林可霉素對大觀霉素在本實驗條件下的干擾試驗。結果表明，當用同時含10g/ml林可霉素和10g/ml大觀霉素的標準混合溶液按上述方法進行測定時，無林可霉素色譜峰，僅有大觀霉素峰，且其保留時間及峰面積與單獨測定10g/ml大觀霉素標準溶液時一致，說明林可霉素對大觀霉素的測定無影響。 3 討論 (1

15、)抽提液的選擇 氨基糖苷類抗生素與組織成分結合較緊密，從組織樣品(尤其是腎)中抽提本品要比從體液中困難的多，迄今為止，報道的方法不多5，7，11，且靈敏度不高，只適于測定氨基糖苷類抗生素殘留量高的樣品(如腎)。Schermerhorn等10報道先用三氯乙酸沉淀試樣中的蛋白質，再用二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯按順序液液萃取，但此試樣中的共萃物對色譜柱的分離有干擾，影響了檢測的靈敏度，且步驟復雜，回收率低。本方法采用三氯乙酸勻漿抽提以脫去蛋白，然后再加二氯甲烷以除去脂溶性物質，結果表明本抽提方法簡單可行，回收率較高，且能保證檢測的靈敏度。 (2)凈化方法的選擇 由于Hornish等使用的自動凈化系統(tǒng)

16、7不符合國內多數(shù)實驗室配置條件，且CBA陽離子固相萃取柱在萃取操作過程要求精確調節(jié)pH值、溫度及離子強度，所需條件難以掌握，且樣品回收率較低，故本試驗采用LC?SCX陽離子固相萃取小柱凈化，其僅能保留試樣中的干擾成分，而不能保留試樣中的殘留藥物，并使之濾過流出，起到較好的凈化作用。為盡可能多的除掉試樣中的雜質，以免進樣后堵塞HPLC系統(tǒng)或污染色譜柱，本方法在試樣經(jīng)LC?SCX陽離子固相萃取小柱凈化后采用水性濾膜進一步過濾，結果證實本處理對保護色譜柱是有利的，也是可行的。 (3)流動相的選擇及工作電極電壓的確定 本方法經(jīng)多次重復證明，大觀霉素的保留時間與離子對緩沖液中庚烷磺酸鈉(在其濃度不大于檸

17、檬酸濃度范圍內)濃度成正相關，與流動相中乙腈的濃度成負相關。當采用檸檬酸離子對緩沖體系(0.02mol/L檸檬酸0.004mol/L庚烷黃酸鈉，50% NaOH調pH至6.10)乙腈(體積比為92.57.5)為流動相時，大觀霉素有適宜的保留時間(保留時間為915min)，與雜質能完全分離，并能達到基線分離，且峰形良好。 為提高選擇性及信燥比，必須優(yōu)化電化學檢測器工作電極的電壓，過高外加電壓使電化學檢測器噪聲增加且干擾嚴重；如外加電壓不足，則又使信號變小，電化學檢測器靈敏度降低。本方法選擇1.02.0V的工作電壓來分析大觀霉素經(jīng)證實是恰當?shù)摹?4 結論 根據(jù)我國HPLC及凈化系統(tǒng)的配置情況，并結

18、合離子對色譜及電化學檢測的優(yōu)點，該分析方法為一種簡單的直接測定動物源食品中大觀霉素殘留的方法，其檢測限、回收率、重復性和線性范圍均能滿足現(xiàn)行獸藥殘留分析的要求?！緟⒖嘉墨I】 1 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南化學藥品卷S. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：322 Burton S D, Hutchins J E, Fredericksen T L, et al. High?performance liquid chromatographic method for the determination of spectinomycin in turkey plasma J. J Chromatogr,1991,571:2093 Haagsma N, Keegstra J R, Scherpenisse P. High?performance liquid chromatographic determination of spectinomycin in swine, calf and chicken plasma J. J Chromatogr,1993,615(2):2894 Bergwerff A A, Scherpenisse P, Haagsma N. HPLC determination of residues of spectin