試驗(yàn)七++細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)與耐藥性檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)及耐藥性檢測(cè)目的和要求】1. 掌握紙片擴(kuò)散法( K-B 法)、液體稀釋法兩種藥敏試驗(yàn)的原理和方法。2. 熟悉上述兩種藥敏試驗(yàn)方法的應(yīng)用。3. 了解幾種細(xì)菌耐藥表型檢測(cè)的原理、方法及意義。 【試劑與器材】1. 培養(yǎng)基：一般需氧和兼性厭氧菌采用水解酪蛋白(M-H)瓊脂或 M-H液體培養(yǎng)基(pH7.27.4 )。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌，則需在M-H培養(yǎng)基中加入其它營(yíng)養(yǎng)成分。2. 抗菌藥物紙片：直徑為6.06.35mm 的濾紙片上，含有一定量的某種抗菌藥物。市場(chǎng)有售，但生產(chǎn)廠家須獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA批準(zhǔn)。不同種類的待測(cè)菌藥敏試驗(yàn)選擇不同的抗菌藥物，藥敏紙片的選擇見表

2、 7-1 。3. 待測(cè)細(xì)菌接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂經(jīng) 35C 1618h的純培養(yǎng)物。4. 0.5% 麥?zhǔn)媳葷峁?配制方法如下：0.048mol BaCl 2 (1.17% W/V BaCl 2 . 2H 2O) 0.5ml0.18mol H 2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 將二液置冰水浴中冷卻后混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期 為 6 個(gè)月。5. 其它：無(wú)菌生理鹽水、無(wú)菌棉簽、無(wú)菌試管、酒精燈、鑷子、生物安全柜、培養(yǎng)箱 等?！緦?shí)驗(yàn)容】一、紙片擴(kuò)散法( K-B 法)藥敏試驗(yàn)1 .原理將含有定量的抗菌藥物紙片貼在已接種待測(cè)細(xì)菌的瓊脂平板表面，紙片上的藥物隨即溶于瓊脂中，并沿

3、紙片周圍由高濃度向低濃度擴(kuò)散，形成逐漸減少的梯度濃度。在紙片周圍， 一定濃度的藥物抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)從而形成了透明的抑菌環(huán)，抑菌環(huán)的大小則反映了待測(cè)菌對(duì)該種藥物的敏感程度。K-B法是由Kirby - Bauer建立，美國(guó)NCCLS推薦，目前為世界所公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散 法(定性法) 。2.方法(1) 培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：將無(wú)菌 M-H瓊脂加熱融化，趁熱傾注入無(wú)菌的直徑 90mm平皿中。 瓊脂厚為4m(約2325ml培養(yǎng)基)，瓊脂凝固后塑料包裝放 4C保存，在5日用完，使用前 應(yīng)在37C培養(yǎng)箱放置30min使表面干燥。(2) 試驗(yàn)菌液準(zhǔn)備：將待測(cè)細(xì)菌接種于普通瓊脂平板， 35C培養(yǎng) 1618h，然后從平板

4、 上挑取數(shù)個(gè)菌落， 于 23ml 無(wú)菌生理鹽水中混勻后與 0.5 麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔?調(diào)整濁度與標(biāo)準(zhǔn) 比濁管相同，其細(xì)菌濃度相當(dāng)于 108 CFU/ml。(3) 細(xì)菌接種：用無(wú)菌棉拭蘸取已調(diào)試的菌液，在管壁上稍加擠壓之后，手持棉拭于M-H瓊脂表面均勻劃線接種，共劃3次，每次將平板旋轉(zhuǎn) 60角，最后沿平板緣涂抹一周，蓋上平板，室溫下置 35min 待瓊脂表面的水分稍干。( 4)貼紙片 用無(wú)菌鑷子夾取藥物紙片平貼在種好細(xì)菌的瓊脂表面，每個(gè)平板可貼 46 種藥物紙片。紙片放置要均勻，各紙片中心距離不小于24mm紙片距平板邊緣的距離應(yīng)不小于15mm紙片一旦接觸瓊脂表面，就不能再移動(dòng)。(5) 培養(yǎng)：貼好藥

5、物紙片的平板應(yīng)于室溫下放置15mi n,然后翻轉(zhuǎn)平板，放 35C培養(yǎng) 1824h 之后觀察結(jié)果。3結(jié)果觀察和報(bào)告 將平板置于黑背景的明亮處,用卡尺從背面精確測(cè)量包括紙片直徑在的抑菌環(huán)直徑, 測(cè)得結(jié)果以毫米為單位進(jìn)行記錄，最后參照NCCLS的標(biāo)準(zhǔn)(見附錄)進(jìn)行結(jié)果判斷，并以敏感( sensitivity )、中度敏感( morderate sensitivity )和耐藥( resistant )等程度報(bào)告 之。4注意事項(xiàng)( 1)培養(yǎng)基的成分、酸堿度以及平板的厚度等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都可以造成影響。購(gòu)買培養(yǎng) 基時(shí)應(yīng)考慮其質(zhì)量, 對(duì)每批 M-H 瓊脂平板均需用標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè), 合格后方可使用。 制備平板 時(shí)

6、,注意其厚度并且厚薄要均勻。( 2)藥物紙片的貼放要均勻,并且要充分接觸瓊脂。藥物紙片應(yīng)始終保存在封閉、冷凍、干燥的環(huán)境，否則會(huì)影響其活性。長(zhǎng)期儲(chǔ)存須置-20C的冰箱，日常使用或沒用完的紙片應(yīng)及時(shí)放4C保存，用時(shí)須提前 12 h取出放室溫平衡。紙片應(yīng)在有效期使用。( 3)菌液濃度也可影響試驗(yàn)的結(jié)果,濃度大細(xì)菌多時(shí)抑菌環(huán)減小；菌量少時(shí)抑菌環(huán)則 偏大。此外,菌液配好后應(yīng)在 15min 用完。(4) 培養(yǎng)溫度以35C為宜。平板的堆放不超過(guò)2塊，防止受熱不均。( 5)試驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按要求操作,嚴(yán)格無(wú)菌操作。(6) 抑菌環(huán)的測(cè)量要仔細(xì)、精確。5.質(zhì)量控制：以新鮮傳代的金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃

7、希菌 ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853等標(biāo)準(zhǔn)菌株在相同條件下用與常規(guī)試驗(yàn)相同的方法測(cè)定對(duì)同種抗菌 藥物的敏感性, 標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌環(huán)應(yīng)在預(yù)期的圍。 如超出了該圍, 則不能向臨床發(fā)報(bào)告,應(yīng) 及時(shí)查出原因，予以糾正。標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)每周用M-H瓊脂傳代，4C保存。6 .臨床意義：用于臨床細(xì)菌常規(guī)藥敏檢測(cè),監(jiān)測(cè)細(xì)菌的耐藥變遷,指導(dǎo)臨床用藥。二、試管稀釋法1. 原理將待測(cè)細(xì)菌種于一系列含有不同濃度抗菌藥物的液體培養(yǎng)基中,定量測(cè)定抗菌藥物抑制或殺死該菌的最低抑菌濃度( minimal inhibitory concentration,MIC)或最低殺菌濃度( minimal bacterici

8、dal concentration,MBC)。2. 方法( 1)抗菌藥物原液的配制：試驗(yàn)用的抗菌藥物應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)的粉劑,選擇適宜的溶劑和稀 釋劑進(jìn)行溶解和稀釋(表7-2 ),并配成一定濃度(通常為1000U或1000卩g/ml )的藥物原液。原液以過(guò)濾法除菌，小量分裝使用，放-20C以下一般可保存三個(gè)月，如果置4C只能保存一周。(2)待測(cè)菌液的準(zhǔn)備：分純的平板上挑取45個(gè)菌落，接種于35ml M-H肉湯中35C 培養(yǎng)46h,與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝恢螅儆肕-H肉湯按1 : 200 稀釋，并在 15min 接種。（ 3）試驗(yàn)方法：1 ）排列試管：取無(wú)菌試管 1015 支排列

9、于試管架上，除第一管外，其余每管加入 M-H 液體培養(yǎng)基 1ml 。2 ）藥物稀釋：吸取抗菌藥物原液（1000卩g/ml） 5.12ml和液體培養(yǎng)基4.88ml加入一 無(wú)菌大試管中，充分混合后，從中吸出 2ml分別加入第一、第二管中，每管 1ml ;第二管混 勻后吸出1ml加入到第三管，以此類推直至最后一管， 從最后一管吸出1ml棄去；經(jīng)如此稀 釋，各管的藥物濃度依次為 512、 256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.125、 0.06、0.03卩g/ml ;另設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照、待測(cè)菌生長(zhǎng)對(duì)照和質(zhì)控菌生長(zhǎng)對(duì)照管。3） 細(xì)菌接種：將已準(zhǔn)備好的菌

10、液分別加入到上述各試驗(yàn)管和對(duì)照管中，每管0.05ml ， 輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。4）培養(yǎng)：置35C培養(yǎng)1218h后觀察結(jié)果。3結(jié)果判斷及報(bào)告將試管拿出逐一對(duì)光觀察， 凡無(wú)肉眼可見細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為對(duì)待測(cè)菌的最低 抑菌濃度（MIC）。并以MIC報(bào)告之。如果以 0.01ml 容量接種環(huán)從無(wú)菌生長(zhǎng)的試管中移種一環(huán)于血瓊脂平板上劃線作次代培養(yǎng)，經(jīng)35C培養(yǎng)過(guò)夜后，觀察能殺死99.9%的種入菌的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度（ MBC）。4注意事項(xiàng)（1）培養(yǎng)基的pH、滲透壓和電解質(zhì)均可影響試驗(yàn)結(jié)果。（ 2）抗菌藥物必須使用標(biāo)準(zhǔn)粉劑，不應(yīng)使用口服藥而影響其含量。配好后的藥物原液 應(yīng)在有效期使用?？紤]到抗菌藥

11、物的效力，不同藥物應(yīng)選擇不同的稀釋度。（ 3）試驗(yàn)過(guò)程易污染，應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作。（4）結(jié)果應(yīng)在 1218h 觀察，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，被輕度抑制的部分細(xì)菌可能會(huì)重新生長(zhǎng)， 由于某些抗菌藥物不夠穩(wěn)定，時(shí)間長(zhǎng)了其抗菌活性也會(huì)降低，甚至消失，從而使MIC增高。5. 質(zhì)量控制：每次試驗(yàn)應(yīng)選用金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌 ATCC25922糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌 ATCC27853等標(biāo)準(zhǔn)菌株在相同條件下作平行試驗(yàn)。 如果 標(biāo)準(zhǔn)菌株的試驗(yàn)結(jié)果超過(guò)或低于預(yù)期值一個(gè)稀釋度以上，不應(yīng)發(fā)出臨床報(bào)告， 而應(yīng)找出差錯(cuò)的原因。6. 臨床意義：多用于抗菌藥物抗菌效力的測(cè)定，新藥開發(fā)。目前臨床的自動(dòng)

12、化或半自 動(dòng)化的藥敏試驗(yàn)多采用與次類似的微量稀釋法。三、部分細(xì)菌耐藥表型的檢測(cè)1.耐甲氧西林葡萄球菌的檢測(cè)（頭孢西丁紙片擴(kuò)散法）甲氧西林 （methicillin） 是一種能耐青霉素酶的半合成青霉素。耐甲氧西林金黃 色葡萄球菌 （methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA） 因多了一個(gè)由 mec A基因編碼的青霉素結(jié)合蛋白（PBPa ）而對(duì)甲氧西林耐藥。這種PBPa不但與酰胺類抗生素的親和力極低， 而且具有其他高親合力青霉素結(jié)合蛋白 （PBPs） 的功能。 當(dāng)其他 PBPs被b-酰胺類抗生素抑制而不能發(fā)揮作用時(shí)，PBPa可替代它們完成細(xì)菌細(xì)

13、胞壁的合成，從而使細(xì)菌得以生存。MRSA從1961年發(fā)現(xiàn)至今幾乎遍及全球，已成為院感染的重要病 原菌之一。因此，開展對(duì)MRSA的檢測(cè)，對(duì)于控制醫(yī)院感染的流行，指導(dǎo)臨床治療有著十分重要的意義。（1 ）原理：同紙片擴(kuò)散法。由于頭孢西丁和苯唑西林較甲氧西林穩(wěn)定，不易失活，通 常使用這兩種藥物代替甲氧西林測(cè)定葡萄球菌的耐藥性。（2）方法：以無(wú)菌棉拭蘸取已調(diào)試的待測(cè)菌液接種于M-H瓊脂平板上（同 K-B法），再貼上頭孢西丁藥物紙片（30卩g/片）或苯唑西林藥物紙片（1卩g/片），將平板置于 35C 培養(yǎng)24h，之后觀察結(jié)果。（ 3）結(jié)果判斷：頭孢西丁紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)20mm為敏感，w 19

14、mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌25 mm為敏感，w 24 mm為耐藥。苯唑西林紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)13 mm為敏感，w 10 mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌18 mm為敏感，w 17 mm為耐藥。（ 4）注意事項(xiàng)：1） 頭孢西丁法結(jié)果觀察時(shí)應(yīng)使用反射光線。苯唑西林紙片法結(jié)果需對(duì)著透射光線觀察， 抑菌環(huán)有任何可辨別的細(xì)菌生長(zhǎng)即為苯唑西林耐藥。2）培養(yǎng)溫度應(yīng)為3335C，超過(guò)35C耐藥的葡萄球菌可能被抑制不能生長(zhǎng)而漏檢。2腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)超廣譜b - 酰胺酶的檢測(cè)超廣譜 b - 酰胺酶（ extended - spectrum b -lactamase,ESBLs ）是指能水解青霉素類 和頭

15、孢菌素類抗生素并擴(kuò)展到能水解第三、 第四代頭孢菌素以及單環(huán)類抗生素并由質(zhì)粒介導(dǎo) 的B -酰胺酶。自1983年德國(guó)首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道以來(lái)，在全世界ESBLs檢出率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)。并具有多重耐藥和轉(zhuǎn)移迅速等特點(diǎn)，極易導(dǎo)致院交叉感染和耐藥菌的擴(kuò)散。產(chǎn)生 ESBLs的細(xì)菌主要是大腸埃希氏菌、肺炎克雷白氏菌、陰溝腸桿菌，其他如銅綠假單胞菌、 變形桿菌屬及不動(dòng)桿菌屬也可產(chǎn)生。對(duì)ESBLs有多種方法可以進(jìn)行檢測(cè)，目前主要采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS所推薦的紙片擴(kuò)散法、稀釋法，并分篩選實(shí)驗(yàn)和確認(rèn)實(shí) 驗(yàn)兩步進(jìn)行。（ 1 ）篩選試驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法）1）藥物紙片：頭孢泊肟 （Cefprozil,CPD）

16、10 卩g/片 或頭孢他啶（Ceftazidime,CAZ） 30 g/ 片 或 氨曲南（Aztreonam,ATM） 30 卩 g/ 片 或 頭孢噻肟（Cefotaxime,CTX） 30 卩g/片 或 頭孢曲松（Ceftriaxone,CRO） 30 卩 g/ 片）2 ）方法：將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌液涂抹于M-H瓊脂平板上，稍干后，在瓊脂培養(yǎng)基表面貼上頭孢他啶等藥物紙片（同K-B法），之后放35C溫箱中培養(yǎng)16-18h觀察結(jié)果。3）結(jié)果判斷：頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑w 17mm頭孢他啶抑菌環(huán)直徑w 22mm氨曲南抑菌環(huán)直徑w 27mm頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑w 27mm 頭孢曲松抑菌環(huán)直徑w 25m

17、m符合以上任何一項(xiàng)即可認(rèn)為該菌能產(chǎn)ESBLs。4）質(zhì)量控制：以大腸埃希菌ATCC25922做質(zhì)控，其抑菌環(huán)直徑應(yīng)符合CLSI質(zhì)控圍。以肺炎克雷伯菌ATCC700603做質(zhì)控，其抑菌環(huán)直徑應(yīng)符合以下要求：頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑 916mm 頭孢他啶抑菌環(huán)直徑 1018mm 氨曲南抑菌環(huán)直徑 917mm 頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑 1725mm 頭孢曲松抑菌環(huán)直徑 1624mm（2）表型確證試驗(yàn)（雙紙片增效法）1） 原理：克拉維酸可與多數(shù)3 -酰胺酶牢固結(jié)合，生成不可逆的結(jié)合物，為一種非常有效的抑制劑。在同一平板上貼加克拉維酸紙片，可以抑制細(xì)菌3-酰胺酶的作用，從而使頭孢他啶等抗菌藥物的抑菌環(huán)增大。2）藥敏紙

18、片：頭孢他啶（30卩g/片）克拉維酸（Clavulanic Acid, CLA 10 g/ 片）頭孢噻肟（30卩g/片）3） 方法：將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌液涂抹于 MH瓊脂平板上（同K-B法），稍干后，在 瓊脂培養(yǎng)基表面分別貼上頭孢他啶和頭孢他啶 /克拉維酸，頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸紙 片，置35C 1618h培養(yǎng)后量取抑菌環(huán)直徑。4）結(jié)果判斷：與單紙片平皿對(duì)照，兩種藥物中的任何一種若加克拉維酸紙片較未加克 拉維酸紙片抑菌環(huán)直徑 5mm即為ESBL陽(yáng)性。5）質(zhì)量控制以大腸埃希菌ATCC25922所測(cè)試藥物聯(lián)合克拉維酸后的抑菌環(huán)直徑與單藥抑菌環(huán)相比， 增大值w 2mm。肺炎克雷伯菌 ATC

19、C700603頭孢他啶/卡拉維酸抑菌環(huán)直徑應(yīng)增大 5mm頭孢噻肟/克 拉維酸抑菌環(huán)直徑應(yīng)增大3mm【結(jié)果記錄和報(bào)告】表7-1非苛氧菌常規(guī)試驗(yàn)和報(bào)告中應(yīng)考慮的抗微生物藥物推薦分組腸桿菌科細(xì)菌銅綠假單胞菌葡萄球菌屬腸球菌屬A組一級(jí)試驗(yàn)并常規(guī)報(bào)告的藥物氨卞西林頭孢他啶本唑西林青霉素或氨卞西林頭孢唑啉頭孢噻吩慶大霉素青霉素美洛西林或 替卡西林 哌拉西林慶大霉素B組一級(jí)試 驗(yàn)有選擇 報(bào)告的藥 物阿米卡星阿米卡星阿奇霉素或達(dá)托霉素阿莫西林/克拉維酸或 氨卞西林/舒巴坦哌拉西林/他唑巴坦氨曲南 頭孢哌酮克拉霉素或紅霉素克林霉素利奈唑胺替卡西/克拉克維酸達(dá)托霉素頭孢孟多或頭孢尼西或頭孢呋辛利奈唑胺奎奴普汀/達(dá)

20、福普汀泰利霉素頭孢吡肟頭孢吡肟甲氧卞啶/磺 胺甲噁唑頭孢美唑 頭孢哌酮 頭孢替坦 頭孢西丁環(huán)丙沙星左氧氟沙星萬(wàn)古霉素萬(wàn)古霉素亞胺培南美洛培南頭孢噻肟或頭孢唑肟或頭孢曲松厄他培南亞胺培南或美洛培南妥布霉素美洛西林或哌拉西林替卡西林甲氧卞啶/磺胺甲噁唑C組補(bǔ)充試 驗(yàn)有選擇 報(bào)告的藥 物氨曲南頭孢他啶奈替米星氯霉素慶大霉素環(huán)丙沙星或左氧氟沙星 加替米星或 莫西沙星鏈霉素氯霉素氯霉素 紅霉素 四環(huán)素 利福平卡那霉素奈替米星四環(huán)素奎奴普汀/達(dá)福普汀妥布霉素慶大霉素 利福平 四環(huán)素U組補(bǔ)充試 驗(yàn)有選擇 報(bào)告的藥 物羧卞西林羧卞西林美羅沙星或 諾氟沙星環(huán)丙沙星 左氧氟沙星諾氟沙星西諾沙星或諾氟沙星 或氧氟沙星羅美沙星或諾氟沙星或氧氟沙星呋喃妥因呋喃妥因加替沙星磺胺異噁唑氯碳頭孢甲氧芐啶四環(huán)素呋喃妥因磺胺異噁唑甲氧芐啶/磺胺甲噁唑注：試驗(yàn)常規(guī)抗菌藥物選擇 在標(biāo)準(zhǔn)中分成 A B C、U四組：A組所列的抗生素為常規(guī)首選藥敏試驗(yàn)藥物。B組為臨床使用的主要抗生素 ，尤其在醫(yī)院感染時(shí)使用的抗生素，可在下列情況下使用:對(duì)A組同類抗生素耐藥；標(biāo)本來(lái)源不同時(shí)，如三代頭孢菌素使用于腦脊液中的腸桿菌， 磺胺甲惡唑使用于尿道分離的細(xì)菌；多種微生物感染；多部位感染；感染流行的控制;對(duì)A組抗生素過(guò)敏、耐受或無(wú)反應(yīng)。C組藥物用于對(duì)A組藥物耐藥的流行菌株或?qū)?A組藥物過(guò)敏的病