針對(duì)包裝信號(hào)起始區(qū)的硫代反義核苷酸抗HBV的研究

1、針對(duì)包裝信號(hào)起始區(qū)的硫代反義核苷酸抗HBV的研究【 摘要 】目的篩選高效特異的抗HBV反義核酸藥物。 方法針對(duì)HBV包裝信號(hào)起始區(qū)設(shè)計(jì)并合成硫代反義寡聚核苷酸(s-asODN)片段，通過(guò)ELISA檢測(cè)法、MTT法、電子顯微鏡等觀察，研究此s-asODN對(duì)HBsAg、HBeAg和HBcAg表達(dá)，以及對(duì)性，細(xì)胞形態(tài)的影響。 結(jié)果針對(duì)起始區(qū)的s-asODN顯著抑制HBsAg、HBeAg和HBcAg的表達(dá)，其中，對(duì)HBeAg和HBcAg的抑制率分別為38.1%和58.7%高于S基因起始區(qū)(32.1%和37.2%,P0.01),對(duì)HBsAg抑制率為82%，低于S基因起始區(qū)(93.41%)，在實(shí)驗(yàn)濃度下s

2、-asODN對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，對(duì)細(xì)胞形態(tài)無(wú)影響。 結(jié)論HBV包裝信號(hào)區(qū)是反義核酸抗HBV復(fù)制研究的重要的靶序列選擇區(qū)域?！?主題詞 】肝炎病毒，乙型包裝信號(hào)核苷酸類，反義 Study on the anti-HBV activity of antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide of gene initiatorHan Jinxiang,Wang Yulin,Zhang Cui,et al.Shandong Medical Biotechnology Centre,Ji?nan 250062【 Abstract 】ObjectiveTo ex

3、plore a new specific anti-HBV agent. MethodsAccording to the sequence of HBV genome,an antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide (s-asODN) of gene initiator was designed and synthesized.The inhibition of HBsAg,HBeAg and HBcAg expression and cytotoxicity and cellular morphology also were studie

4、d with ELISA,MTT colorimetric assay and scanning electron microscopy. Resultss-asODN of gene could inhibit expression of HBsAg,HBeAg and HBcAg.Both the inhibition rates (38.1% and 58.7%) of HBeAg and HBcAg were higher than gene S initiator (32.1% and 37.2%,P0.01) and the inhibition rate (82.0%) of H

5、BsAg was lower than gene S initiator (93,4%),s-asODN was apparently not cytotoxic and induced no effect of morphology on HepG2 2215 cells. ConclusionThe gene is important target gene for the antisense oligonucleotide anti-HBV replication.【 Subject words 】Gene Oligodeoxynucleotides,antisense Hepatiti

6、s B virusHBV包裝是HBV復(fù)制過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，起始于C基因兩個(gè)起始密碼ATG間的3.5kb轉(zhuǎn)錄體能被病毒核心顆粒所包裝，是前基因組RNA(PgRNA)這一高度特異的包裝過(guò)程，它主要取決于PgRNA近5?端的一段順式序列，即包裝信號(hào) 。研究發(fā)現(xiàn) 不僅在PgRNA選擇性包裝過(guò)程中起決定性作用，并且與基因組逆轉(zhuǎn)錄有密切關(guān)系1。因此該區(qū)是理想的基因水平治療HBV的靶序列，通過(guò)設(shè)計(jì)合成針對(duì)起始區(qū)的硫代反義寡聚核苷酸，我們首次研究了其對(duì)HBV細(xì)胞的HBsAg、HBeAg和HBcAg表達(dá)的影響，并對(duì)其細(xì)胞毒性及形態(tài)進(jìn)行了研究，以期篩選高效特異的抗HBV反義核酸藥物。材料與方法1.細(xì)胞株和培養(yǎng)基：

7、2.2.15細(xì)胞為HBV-DNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞，由中國(guó)醫(yī)科院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，Eagle?s MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、G418為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品。2.s-asODN的設(shè)計(jì)合成及純化：參照Ono Y等2克隆的HBV DNA序列，選擇18431861位點(diǎn)作為包裝信號(hào)()起始區(qū)的靶序列，s-as ODN序列為5-AGT AGG ACA TGA ACA TGA-3，以S基因起始區(qū)序列和核心起始區(qū)作為對(duì)照，S基因起始區(qū)靶位點(diǎn)位于148163，s-asODN序列為5-GTTCTC CAT GTT CAG C-3，核心(C)起始區(qū)靶位點(diǎn)位于19051920，asODN序列為5-AAG GG

8、T CGA TGT CCA T-3，非互補(bǔ)序列為5-GTC ACT GCT TCT GAG-3作為陰性對(duì)照，固相亞磷酰胺三脂合成法在391A DNA 合成儀(美國(guó)ABI公司產(chǎn)品)上由本實(shí)驗(yàn)室合成，純化采用OPC(Oligonucleutide Purification Cartridge)純化法3。3.s-asODN抗HBV活性測(cè)定：2.2.15細(xì)胞于對(duì)數(shù)分裂期經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，接種96孔培養(yǎng)板(2103個(gè)/孔)，置5% CO2 37培養(yǎng)4日，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，加入不同劑量各種asODN，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不含藥物的對(duì)照，培養(yǎng)3天后，ELISA測(cè)定HBsAg、HBeAg和HBcAg含

9、量(試劑盒購(gòu)自廈門新創(chuàng)科技有限公司)?？乖种坡拾聪铝泄接?jì)算：抑制率=(實(shí)驗(yàn)孔P/N值-對(duì)照孔P/N值)/(對(duì)照孔P/N-2.1)100%注：P/N表示陽(yáng)性孔A值/陰性孔A值4.MTT(四唑鹽)比色實(shí)驗(yàn)：參考文獻(xiàn)4，細(xì)胞處理同上，培養(yǎng)3天后加入MTT(5mg/ml),每孔20l，加培養(yǎng)液MEM繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，離心，棄上清，每孔加入150l，二甲基亞砜(DMSO)溶解結(jié)晶物，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(華東電子管廠DG-3022A)上測(cè)定570nm和630nm的A值，asODN對(duì)細(xì)胞的殺傷率按下列公式計(jì)算。5.細(xì)胞形態(tài)電鏡觀察：24孔培養(yǎng)板，孔內(nèi)放入無(wú)菌的622mm的蓋玻片后，接種2.2.15細(xì)胞(10

10、5個(gè)/孔)，加藥培養(yǎng)3天，浸入PBS漂洗，將細(xì)胞薄片經(jīng)2.5%戊二醛過(guò)夜后1%鋨酸4固定1小時(shí)，梯度酒精脫水，常規(guī)臨界點(diǎn)干燥，用I-5離子濺射儀鍍鉑，在5-570型電子顯微鏡下(日本島津公司)觀察細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，并拍照。結(jié)果1.劑量相關(guān)性抑制作用：非互補(bǔ)asODN在20mol/L時(shí)，對(duì)HBsAg、HBeAg、HBcAg的抑制率分別為8.1%，7.2%和8.7%，與表1所示的S基因起始區(qū)和 基因起始區(qū)特異asODN抑制率的差異有極顯著性(P0.01)。S和基因起始區(qū)的asODN抑制HBsAg、HBeAg、HBcAg隨濃度的升高抑制率有增高趨勢(shì)，但對(duì)HBeAg的抑制其線性關(guān)系不明顯，有待進(jìn)一步探討。

11、比較兩種asODN對(duì)不同抗原的抑制效果顯示，起始區(qū)的asODN對(duì)HBcAg和HBeAg表達(dá)抑制效果明顯優(yōu)于S起始區(qū)，說(shuō)明針對(duì)基因的asODN更有效地抑制HBV復(fù)制。S起始區(qū)的asODN對(duì)HBsAg表達(dá)抑制效果優(yōu)于起始區(qū)。2.聯(lián)合用藥的協(xié)同作用：為了探討s-asODN聯(lián)合用藥協(xié)同作用，降低各藥的用藥量，為臨床應(yīng)用探索有效治療方案，我們?cè)O(shè)計(jì)s-asODN S基因起始區(qū)、包裝信號(hào)區(qū)、核心起始區(qū)聯(lián)合用藥，結(jié)果如表2。結(jié)果顯示，包裝信號(hào)起始區(qū)asODN與其它asODN聯(lián)合用藥在同樣效果下可大大降低用藥的劑量，說(shuō)明asODN聯(lián)合用藥有協(xié)同作用。表1不同濃度s-asODN對(duì)HBV細(xì)胞HBeAg、HBsAg、

12、HBcAg表達(dá)的影響Table 1. Effect of multiple doses of s-asODN on HBsAg,HBeAg and HBcAg expressionInitiator/Gene S(%)Inititator/Gene (%)2.551020(mol/L)2.551020(mol/L)HBsAg33.62.170.62.569.23.093.42.99.41.137.42.148.62.982.03.4HBeAg29.01.829.42.125.33.132.14.020.32.141.44.036.24.138.13.7HBcAg20.22.025.63.127

13、.82.937.23.418.72.531.22.741.22.858.73.2表2聯(lián)合應(yīng)用asODN對(duì)2.2.15細(xì)胞HBeAg表達(dá)的影響Table 2.Effect of coordination of asODN on HBeAg expression of 2.2.15 cellDose(mol/L)Inhibition of HBeAg(%)5+5+589.412.5+2.5+2.567.263.s-asODN對(duì)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：包裝信號(hào)區(qū)、S基因起始區(qū)s-asODN不同濃度下作用2.2.15細(xì)胞4天后，MTT測(cè)定其細(xì)胞毒性，結(jié)果如表3。上述asODN與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性，說(shuō)明在上述

14、濃度下，asODN對(duì)2.2.15細(xì)胞無(wú)毒性反應(yīng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果也顯示asODN對(duì)2.2.15細(xì)胞增殖無(wú)顯著性影響(P0.05，數(shù)據(jù)未列)光學(xué)顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞無(wú)破碎變形現(xiàn)象。 表3s-asODN對(duì)2.2.15細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)Table 3.The cytotoxic activity of s-asODN to 2.2.15 cellasODNConcentrations of primers(mol/L)2.551020Initiator/Gene 2.9-3.34.23.3Initiator/Gene S7.9-5.77.9-7.14.asODN對(duì)2.2.15細(xì)胞形態(tài)的電鏡觀察：結(jié)果如附，

15、顯示細(xì)胞形態(tài)與正常2.2.15細(xì)胞無(wú)明顯差異，微絨毛的數(shù)量也無(wú)明顯改變，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)代謝良好。附asODN對(duì)2.2.15細(xì)胞電鏡形態(tài)學(xué)觀察Fig . Morphology of asODN to 2.2.15 cella:Control5000b:asODN (for 3 days)5000討論如何抑制HBV在體內(nèi)的復(fù)制是HBV治療最關(guān)鍵的問(wèn)題，HBV包裝信號(hào)區(qū)是HBV復(fù)制不可缺少的步驟之一。研究發(fā)現(xiàn)，病毒多聚酶(P)的包裝與PgRNA的包裝是一個(gè)偶聯(lián)過(guò)程，包裝必需有序列。近年來(lái)，Wang和Seneger等提出HBV DNA合成的真正起始點(diǎn)位于PgRNA與5?端基一環(huán)結(jié)構(gòu)的突起部與序列有關(guān)5，

16、因此，在HBV的復(fù)制中至關(guān)重要，本文選擇起始位點(diǎn)作為asODN靶序列。結(jié)果顯示該asODN能有效抑制HBV HBsAg、HBeAg、HBcAg的表達(dá)，與針對(duì)S基因起始區(qū)的相比，能更有效地抑制與HBV復(fù)制關(guān)系更密切的HBeAg和HBcAg的表達(dá)，但是區(qū)域存在著較復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如何選擇合適的靶位點(diǎn)尚需對(duì)HBV的結(jié)構(gòu)特別是高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，我們選用的序列雖然提高了對(duì)HBeAg和HBcAg表達(dá)的抑制，但從抑制率上看，尚不能認(rèn)為是最佳序列，這可能是由于該區(qū)域二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜所致6，但提示該結(jié)構(gòu)區(qū)域是反義核酸抗HBV研究的重要位點(diǎn)。聯(lián)合用藥是臨床上為了增加療效、減少藥物副作用，經(jīng)常采用的治療策略，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果

17、顯示，將不同靶序列的asODN聯(lián)合用藥后對(duì)HBV抑制效果有顯著的提高，三種asODN有協(xié)同作用，這為將來(lái)臨床聯(lián)合應(yīng)用asODN提供了理論依據(jù)。藥物的毒副作用是篩選藥物的關(guān)鍵指標(biāo)，asODN對(duì)宿主細(xì)胞的增殖及細(xì)胞的形態(tài)有否影響是人們關(guān)注的問(wèn)題。MTT比色實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)狀態(tài)的方法，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶的藍(lán)紫色結(jié)晶物，通過(guò)觀察這種物質(zhì)的有無(wú)和多少判定線粒體功能如何。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，起始區(qū)和S起始區(qū)s-asODN在2.520mol/L濃度時(shí)對(duì)2.2.15細(xì)胞殺傷率均在10%以下，說(shuō)明兩種asODN對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒性，掃描電鏡觀察也顯示s-asODN對(duì)細(xì)胞形

18、態(tài)無(wú)影響，其他作者5，6通過(guò)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白，甲胎蛋白和總蛋白顯示在asODN100mol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性，說(shuō)明s-asODN對(duì)宿主細(xì)胞是一種低毒制劑。 本課題受山東省重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目和山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(編號(hào)：294C1020)作者單位：250062 濟(jì)南，山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心(韓金祥，張翠，李翠玲，王美嶺)；山東醫(yī)科大學(xué)附院(王玉林，彭孟彪)參考文獻(xiàn)1屠紅，聞?dòng)衩?嗜肝DNA病毒包裝信號(hào)的研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)微生物學(xué)分冊(cè)，1997，(20)1-3.2Ono Y,Onda H,Sasada R,et al.The complete nucleotides sequences of the cloned hepatitis B virus DNA; subtype adr and adw.Nucleic Acids Res,1983,11(6) 1747-1757.3韓金祥，張翠，楊曉春，等.OPC純化合成DNA片段方法探討.山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，33173-174.4Moxmann T,Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Imm