實驗四細菌質粒的接合轉移PPT文檔

1、一：目的要求一：目的要求 了解在自然條件下微生物遺傳信息傳遞的了解在自然條件下微生物遺傳信息傳遞的方式；方式； 掌握細菌質粒轉移的原理和流程。掌握細菌質粒轉移的原理和流程。 二：基本原理二：基本原理 在質粒轉移過程中，供體菌與受體菌在質粒轉移過程中，供體菌與受體菌細胞通過結合作用緊密接觸，質粒從細胞通過結合作用緊密接觸，質粒從供體細胞向受體轉移，同時進行質粒供體細胞向受體轉移，同時進行質粒復制，這就是結合轉移的過程。按能復制，這就是結合轉移的過程。按能否自主轉移，將天然存在的質粒分為否自主轉移，將天然存在的質粒分為兩大類。兩大類。 1轉移型質粒轉移型質粒：多為低拷貝的大質粒，含有完整：多為低拷

2、貝的大質粒，含有完整的轉移操縱子基因（的轉移操縱子基因（tra）和轉移起始位點。能在同）和轉移起始位點。能在同種或親緣關系近的菌體細胞間進行轉移。例如：種或親緣關系近的菌體細胞間進行轉移。例如： 大腸桿菌：大腸桿菌：f因子、因子、r1、r100、r6k、rp4 天藍色鏈霉菌：致育性因子天藍色鏈霉菌：致育性因子pscp1、pscp2 2非轉移型質粒非轉移型質粒：多為高拷貝的小質粒，如大腸：多為高拷貝的小質粒，如大腸桿菌的桿菌的cole1、rsf1010等。由于缺少轉移基因等。由于缺少轉移基因（tra），不能自主轉移，但由于含有與），不能自主轉移，但由于含有與f質粒類似質粒類似的的bom（或（或n

3、ic）位點或誘動基因）位點或誘動基因mob（mobilization），因而能被帶有），因而能被帶有tra基因的轉移性基因的轉移性質粒誘動而發(fā)生轉移質粒誘動而發(fā)生轉移。 轉移子的篩選轉移子的篩選 篩選培養(yǎng)基為：篩選培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基+抗生素抗生素； 供體和輔助大腸桿菌均營養(yǎng)缺陷型，不能供體和輔助大腸桿菌均營養(yǎng)缺陷型，不能在基本培養(yǎng)基上生長；在基本培養(yǎng)基上生長； 未轉化成功的受體菌不能在有抗生素的平未轉化成功的受體菌不能在有抗生素的平板上生長。板上生長。三：實驗菌株三：實驗菌株 供體菌：供體菌：e.coli dh5(ptr102) (tcr)，含有，含有 mob基因基因 ； 受體菌受

4、體菌: 紫云英根瘤菌紫云英根瘤菌 ( tcs) ； 輔助菌輔助菌: e. coli mm294 (ppk2073)（sper），），含有含有tra基因?；?。 四：實驗內(nèi)容四：實驗內(nèi)容 準備準備將受體、供體、輔助菌分別培養(yǎng)到對數(shù)期：將受體、供體、輔助菌分別培養(yǎng)到對數(shù)期： 供體菌：供體菌：e.coli dh5(ptr102) (tcr)，lb + tc 20g /ml，37震蕩培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)1夜；夜； 受體菌受體菌: sinorhizobium fredii ( tcs)， ty, 28震蕩培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)2天；天； 輔助菌輔助菌: e. coli mm294 (ppk2073)（sper），），lb

5、 + spe 50 g/ml 37震震蕩培養(yǎng)蕩培養(yǎng)1夜夜 用可調(diào)定量移液器吸取供體、輔助菌各用可調(diào)定量移液器吸取供體、輔助菌各 0.4ml，吸受體菌吸受體菌0.6ml，都加入同一，都加入同一eppdorf管內(nèi)（每個管內(nèi)（每個同學做同學做1管），放入離心機內(nèi)，管），放入離心機內(nèi)，10000轉轉/min 離離心心1分鐘。分鐘。 倒上清，向沉淀加倒上清，向沉淀加 1ml 的的 ty液體，用液體，用 tip上下抽上下抽吸，洗滌菌體，再吸，洗滌菌體，再10000轉轉/min離心離心1分鐘，倒上分鐘，倒上清，留清，留100l左右用于懸浮菌體。左右用于懸浮菌體。 倒倒ty平板，然后用鑷子取滅菌濾紙片貼于已準

6、備平板，然后用鑷子取滅菌濾紙片貼于已準備好的好的ty平板上（平板上（每每2個同學個同學1片，片，2-3片片/平板平板）。）。用用200l的的 tip 抽吸抽吸eppdorf管內(nèi)沉淀的菌體，打管內(nèi)沉淀的菌體，打散成濃菌液，將之加到濾紙片中央（切勿傾斜平散成濃菌液，將之加到濾紙片中央（切勿傾斜平板，以免菌液流出濾紙片以外）板，以免菌液流出濾紙片以外）,吹干。吹干。 28培養(yǎng)培養(yǎng)2天。天。 操作步驟（第一天）操作步驟（第一天） 倒倒sm平板平板 將基本培養(yǎng)基（將基本培養(yǎng)基（sm）溶化，加千分之一的）溶化，加千分之一的維生素混合液，然后加相應量的四環(huán)素維生素混合液，然后加相應量的四環(huán)素（15u/ml）

7、，每），每2人人1皿。皿。 另準備另準備1瓶基本培養(yǎng)基，不加抗生素，用于瓶基本培養(yǎng)基，不加抗生素，用于對照。對照。 將倒好的平板用報紙包好后放入將倒好的平板用報紙包好后放入4冰箱，冰箱，備用。（備用。（注：四環(huán)素在強光下易分解注：四環(huán)素在強光下易分解） 向滅菌青霉素瓶中加向滅菌青霉素瓶中加3ml無菌水，將已培養(yǎng)無菌水，將已培養(yǎng)的的ty平板上的濾紙片用無菌鑷子放入水中，平板上的濾紙片用無菌鑷子放入水中，在震蕩混勻器上洗菌體，充分打散在震蕩混勻器上洗菌體，充分打散。 向向1ml的的ep管加管加 0.9ml無菌水，取無菌水，取0.1ml菌菌液，混勻。液，混勻。 吸取吸取 200l涂皿。涂皿。 少數(shù)同學另取稀釋液，涂少數(shù)同學另取稀釋液，涂1板不加板不加tc的的sm做對照做對照 。 平板放平板放28 培養(yǎng)培養(yǎng)4-6天后看結果。天后看結果。操作步驟（第三天）操作步驟（第三天） 五：實驗報告內(nèi)容五：實驗報告內(nèi)容轉移頻率轉移頻率=sm+tc平板的單菌落數(shù)平板的單菌落數(shù)/