細(xì)胞原理總結(jié)題庫.doc

1、1 細(xì)胞培養(yǎng)：從活的機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，分散成單個(gè)細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生長條件，在體外建立無菌、 適溫和一定營養(yǎng)條件等， 使其在體外環(huán)境中繼續(xù)生長繁殖的過程，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。2 凈化工作間設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為萬級(jí)3 消毒：殺死病原微生物，但不一定能殺死細(xì)菌芽孢的方法，通常用化學(xué)的方法來達(dá)到消毒的作用，用于消毒的化學(xué)藥物叫做消毒劑。4 滅菌：把物理上所有的微生物全部殺死的方法，通常用物理的方法來到達(dá)滅菌的目的。5 貼壁依賴型細(xì)胞分為 4 型：成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走細(xì)胞型、多型細(xì)胞型6 傳代培養(yǎng)：體外生長的培養(yǎng)細(xì)胞受營養(yǎng)條件、生長空間等因素的限制，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后， 則需要分離出一

2、部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的過程。7 細(xì)胞活力：活細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比8 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融9 細(xì)胞凍存常用保護(hù)劑為 DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑10 細(xì)胞污染和檢測方法：肉眼直接觀察法、培養(yǎng)檢查法、顯微鏡觀察法、 PCR 檢測11 支原體污染的處理：用 MRA處理細(xì)胞、清洗純化法、藥物輔助加溫處理、使用支原體特異性血清12 原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，完成了從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的過渡和適應(yīng)過程，恢復(fù)了分裂增殖和生長發(fā)育的能力13 實(shí)體組織形成細(xì)胞懸液的方法：機(jī)械分散法、消化分離法（上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞）、貼塊培養(yǎng)法（血管平滑肌細(xì)胞）14 懸浮細(xì)胞分離方法（淋

3、巴細(xì)胞）：密度梯度離心15 原代細(xì)胞的純化：自然純化和人工純化（酶消化法、反復(fù)貼壁法、培養(yǎng)及限定方法、流式分選）16 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方式：分批式培養(yǎng)、流加式培養(yǎng)、半連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)17 流式細(xì)胞術(shù)：高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或顆粒，測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度， 從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速多參數(shù)定性或定量檢測和分選的一種細(xì)胞分析技術(shù)。18 流式細(xì)胞儀：以流式細(xì)胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，是集流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、單克隆抗體技術(shù)、 細(xì)胞熒光化學(xué)和計(jì)算機(jī)等學(xué)科知識(shí)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。19 流式細(xì)胞儀特點(diǎn)：單個(gè)細(xì)胞分析、同時(shí)多參數(shù)分析、速度快（ 10000 個(gè)/S

4、 ）、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（提供細(xì)胞群體的均值和分布情況）、分選感興趣的細(xì)胞20 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)照的設(shè)置：空白對(duì)照（自發(fā)熒光 / 本底熒光）：未染色細(xì)胞同型 / 獨(dú)特型對(duì)照：抗原抗體之間是否特異性結(jié)合，排除非特異結(jié)合補(bǔ)償對(duì)照：多色分析時(shí)做每種熒光素單獨(dú)染色的細(xì)胞陽性對(duì)照：確定操作過程的正確性21 熒光補(bǔ)償：利用電子技術(shù)活計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)22 流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示方式：單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)二維點(diǎn)圖、等高線圖、密度圖23 細(xì)胞增殖檢測技術(shù)：直接計(jì)數(shù)：優(yōu)點(diǎn)：不需要特定的試劑和儀器、準(zhǔn)確。缺點(diǎn)：不適合樣品數(shù)量多的情況、不適合評(píng)估特定的亞群胸腺嘧啶核苷摻入法（ 3HTdR）：優(yōu)點(diǎn)

5、：敏感性高、客觀性好、重復(fù)性好。缺點(diǎn)：但需要一定設(shè)備條件，存在放射性核素污染的問題5 溴脫氧尿嘧啶核苷（ Brdu）檢測法：優(yōu)點(diǎn)：不僅能用于體外實(shí)驗(yàn)，還能用于活體實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)： Brdu 需要變性 DNA后才能與抗體結(jié)合，破壞 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響其它染料結(jié)合染色，導(dǎo)致染色彌散，準(zhǔn)確性降低等問題羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂 （CFSE）檢測法：進(jìn)入細(xì)胞后不可逆地與氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)， CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度是親代的一半， 在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中， 各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈對(duì)遞減。MTT檢測法：線粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的 MTT分解成紫色的水不溶

6、性的甲瓚，并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞無此功能， MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力呈正比CCK8：優(yōu)點(diǎn)： a 使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑 b 快速檢測 c 靈敏度很高 d 重復(fù)性優(yōu)于 MTT法 e 細(xì)胞毒性小 f 檢測試劑無需預(yù)制，即開即用。缺點(diǎn)： a 價(jià)格比較貴 b CCK8 試劑為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色相近，容易漏加或多加Ki67（增殖細(xì)胞核抗原）：核增殖標(biāo)志物，無組織特異性，可靠、迅速反映增殖率24 細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)：形態(tài)學(xué)檢測：吉姆薩染色、瑞氏染色、 Hoechst33342、 Hoechst33258、DAPI Annexin V ：凋亡細(xì)胞磷脂酰絲氨

7、酸外翻到細(xì)胞膜外， Annexin V 是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白PI （碘化丙啶）染色：溴化乙錠的類似物，嵌入雙鏈 DNA后釋放紅色熒光， DNA 染色的細(xì)胞核染色試劑， 常用于細(xì)胞凋亡檢測， 能穿過破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。 DNA Fragmentation ：凋亡細(xì)胞 DNA在核小體間發(fā)生有規(guī)律的斷裂，出現(xiàn) 180 200bp 的 DNA片段，壞死細(xì)胞 DNA斷裂為無特征的 DNA片段，進(jìn)行瓊脂糖電泳可區(qū)分凋亡和壞死。TUNEL（脫氧核糖核酸酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）：細(xì)胞凋亡染色體 DNA雙鏈或單鏈斷裂產(chǎn)生大量的粘性 3OH 末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，將脫氧核糖核苷

8、酸和熒光素、 過氧化物酶、 堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到 DNA的 3 末端，從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。線粒體膜電位： 親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)， 其熒光的增強(qiáng)和減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高和降低（熒光顯微鏡檢測、 FACS檢測）細(xì)胞色素 C 釋放：凋亡細(xì)胞中細(xì)胞色素 C 從線粒體向胞質(zhì)釋放 （分別抽提線粒體組分和細(xì)胞質(zhì)組分，用抗細(xì)胞色素 C 的抗體進(jìn)行 western-blot 分析，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素 C 由線粒體向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位）Caspase活性：Caspase3正常以酶原形式存在于胞漿中， 在凋亡的早期階段被激活，可經(jīng) western-blot 分析25 組織工程：應(yīng)用

9、細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，將人體某部分的組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)繁殖、 擴(kuò)增，然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而達(dá)到器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù)。26 組織工程 3 個(gè)支柱：種子細(xì)胞、生長因子、生長支架。27 組織構(gòu)建主要有3 種方式：體內(nèi)構(gòu)建：種子細(xì)胞與生物材料復(fù)合后， 組織尚未完全形成時(shí)即植入體內(nèi)， 組織形成與生物材料降解在體內(nèi)完成。體外構(gòu)建：在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，應(yīng)用生物反應(yīng)器形成組織和器官。原位組織構(gòu)建： 單純植入生物材料支架于體內(nèi)組織缺損部位， 依靠周圍組織細(xì)胞遷移并粘附于生物材料支架， 形成并再生組織， 這種方式并非經(jīng)典的組織工程概念。28 干細(xì)胞的主

10、要特征：圓形或橢圓形、較高的端粒酶活性、增殖緩慢（機(jī)體需要時(shí)進(jìn)入分化）、穩(wěn)定增殖（維持自身數(shù)目）29 干細(xì)胞維持自穩(wěn)性的機(jī)制：不對(duì)稱分裂30 胚胎干細(xì)胞：從胚胎著床前胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)分離的一種全能性細(xì)胞，可以分化成任何一種組織類型的細(xì)胞。31 胚胎干細(xì)胞的分離方法：免疫法、組織培養(yǎng)法、顯微分離法32 iPS 細(xì)胞與 ES細(xì)胞的異同：相同：表達(dá)相同的多能性 marker 、全基因組比對(duì)幾乎相同、都可以培育出小鼠個(gè)體不同：定向分化能力有強(qiáng)弱33 iPS 細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)：不用破壞胚胎，無倫理爭議、不需卵細(xì)胞，來源廣泛、無免疫排斥、可作為研究疾病的模型。34 轉(zhuǎn)染：將外源分子（ DNA、R

11、NA）導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。35 轉(zhuǎn)染的方法：磷酸鈣共沉淀法、 DEAE葡聚糖法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、納米顆粒作為載體的轉(zhuǎn)染、電穿孔法、顯微注射法、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。36 轉(zhuǎn)染方法優(yōu)缺點(diǎn)比較：電穿孔法：優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率較高。缺點(diǎn)：需要昂貴的儀器，對(duì)細(xì)胞的損傷較大（需要更多的細(xì)胞和 DNA）顯微注射法：優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)外源基因沒有長度上的限制，目前已證明數(shù)百kb DNA片段均能成功。缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴、操作技術(shù)需要長時(shí)間練習(xí)、每次只能注射有限的細(xì)胞、不適合大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的需要。磷酸鈣共沉淀法：優(yōu)點(diǎn)：便宜、對(duì)某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高。缺點(diǎn)：細(xì)胞有限制性、重復(fù)性不佳、微小pH改變會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染的失敗DEAE葡聚糖法：優(yōu)點(diǎn)：簡單、重復(fù)性

12、比磷酸鈣共沉淀法好、可轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。缺點(diǎn)：濃度高時(shí)有一定細(xì)胞毒性、不適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染時(shí)要除掉血清。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：優(yōu)點(diǎn)：適用于把 DNA轉(zhuǎn)入懸浮和貼壁培養(yǎng)細(xì)胞， 可用于瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)、 轉(zhuǎn)入效率高，比磷酸鈣法高 5100 倍、能夠轉(zhuǎn)染 DNA和 RNA、轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高。缺點(diǎn)：價(jià)格較貴，不適合大批量轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞毒性較高，可能干擾細(xì)胞代謝。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染：腺病毒載體：優(yōu)點(diǎn)：插入 DNA片段較長、宿主范圍廣，可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞、對(duì)人致病性低、不整合到染色體上，無插入致突變性、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因、與人類基因同源，蛋白產(chǎn)物能有效折疊和修飾、能有效進(jìn)行增殖，滴度高，

13、外源基因表達(dá)效率高、病毒顆粒穩(wěn)定，易于濃縮和純化。缺點(diǎn)：表達(dá)時(shí)間短，需反復(fù)刺激、具有免疫原性，可能刺激宿主。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：優(yōu)點(diǎn)：能夠整合到宿主細(xì)胞、產(chǎn)生假病毒。缺點(diǎn)：只能感染能夠分裂的細(xì)胞、 整合的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致宿主基因組突變、 有潛在致瘤性。慢病毒載體：優(yōu)點(diǎn)：分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均能感染、能夠整合到基因組、免疫原性弱缺點(diǎn)：整合時(shí)同樣有可能導(dǎo)致宿主基因組突變。37 轉(zhuǎn)染效率檢測方法：免疫熒光、流式、western 、PCR38 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體上，不整合到細(xì)胞的染色體上。外源基因?qū)爰?xì)胞 1-2 天后收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測和分析， 一個(gè)宿主細(xì)胞可同時(shí)存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)

14、生高水平的表達(dá)。39 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染： DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體， 外源 DNA整合到染色體上的概率很小，大約 1/10 4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合。通常需要一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。40 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的篩選藥物：G418、 zeocin 、Puromycin41 影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染的主要因素：細(xì)胞狀態(tài)、血清、DNA質(zhì)量、轉(zhuǎn)染技術(shù)42 同源重組：將外源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞染色體上的方法，因?yàn)樵谠撟挥信c導(dǎo)入基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換有缺陷的基因片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。43 位點(diǎn)特異性重組：發(fā)生在兩條 DNA鏈特異位點(diǎn)上的重組，重組的發(fā)生需要一段同源序列即特異性

15、位點(diǎn)（又稱附著點(diǎn) att ）和位點(diǎn)特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。44 基因打靶技術(shù)：利用 DNA同源重組的原理，在基因組中某一特定部位進(jìn)行定點(diǎn)的基因重組，是研究基因功能的有效手段。包括基因敲除和基因敲入。45 反義核苷酸技術(shù)：經(jīng)人工合成和構(gòu)建的反義表達(dá)載體表達(dá)的寡核苷酸片段，長度多為 15-30 個(gè)核苷酸，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，與目的基因DNA或 mRNA結(jié)合。46 鋅指核酸酶技術(shù)： 識(shí)別并結(jié)合指定的位點(diǎn)， 高效且精確地切斷靶DNA。隨后細(xì)胞利用天然的 DNA修復(fù)過程同源定向修復(fù)或非同源末端連接來治愈靶DNA的斷裂，就能夠進(jìn)行基因組編輯，包括基因修復(fù)、基因刪除和定向的基因添加。（效率高、可

16、構(gòu)建 knockout 細(xì)胞、周期短、價(jià)格上沒有優(yōu)勢(shì)）47 TALEN（轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶）：一種人工核酸酶，是用于定向基因打靶的一種新技術(shù)，由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子和核酸酶構(gòu)成。48 TALEN基因敲除基本流程： a 確定靶點(diǎn) b TAL 靶點(diǎn)識(shí)別域的克隆構(gòu)建c 將 TAL靶點(diǎn)識(shí)別域克隆入特定的真核表達(dá)載體以表達(dá)重組核酸酶d 將重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞 e 篩選突變體。49 RNA 干擾技術(shù)：細(xì)胞利用外源或內(nèi)源小干擾RNA激發(fā)相關(guān)的酶復(fù)合物，對(duì)同源性 mRNA進(jìn)行切割、降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達(dá)。50 RNA 干擾現(xiàn)象的幾個(gè)重要特征：轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默機(jī)制、很高的特異性、只有

17、 dsRNA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生、只有針對(duì)編碼區(qū)的 dsRNA才能產(chǎn)生有效和特異性的干擾、作用迅速、連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能有長期效應(yīng)。51 siRNA 制備的方法：化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片段dsRNAs經(jīng) RNase降解、siRNA 表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)形成shRNAs、siRNA 表達(dá)框架52 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法：磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、DNA載體轉(zhuǎn)染、電穿孔法、顯微注射法、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染53 siRNA 效果檢測：從 mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進(jìn)行：mRNA：RTPCR、實(shí)時(shí)定量 PCR、Northern 雜交蛋白質(zhì)： Western 雜交、 ELISA、免疫熒光54 siRNA 應(yīng)用：

18、探索基因功能、基因治療領(lǐng)域、整形外科領(lǐng)域、藥物篩選55 RNA干擾存在的問題：A siRNA 導(dǎo)入體內(nèi)的效率低下，如何有效地將 siRNA 轉(zhuǎn)入體內(nèi)成為 RNAi 應(yīng)用的最大障礙B 體內(nèi) RNA遞送的靶向性C如何在目的基因的序列上選擇 21-23nt 左右的序列作為 siRNA 的模板，從目前的研究來看，序列的選擇原則尚不清楚D siRNA 的穩(wěn)定性E 脫靶效應(yīng)，尤其在多基因家族中的非特異性問題。56 熒光漂白恢復(fù)（ FRAP）：用來測定活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，借助于高強(qiáng)度脈沖激光來照射細(xì)胞某一區(qū)域， 造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅， 該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子會(huì)以一定的速率向受照射區(qū)域擴(kuò)散， 這個(gè)擴(kuò)散速率可通過低強(qiáng)度激光掃描探測，因而可得到活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。57 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FRET）：分子可以看作一個(gè)正負(fù)電荷分離的偶極子，受激發(fā)以一定的頻率振動(dòng)， 如果其附近有一個(gè)振動(dòng)頻率相同的另一個(gè)分子存在， 則通過這兩個(gè)分子的偶極偶極相互作用，能量可以非輻射方式從前者轉(zhuǎn)移到后者。58 共聚焦顯微鏡（ LSCM）應(yīng)用實(shí)例：組織光學(xué)切片、三維圖像重建、細(xì)胞物理與生物化學(xué)測定、熒光的定性定量分析、細(xì)胞內(nèi)離子的動(dòng)態(tài)測量59 共聚焦顯微鏡的局限：標(biāo)記染料的光漂白： 為了獲得足夠的信噪比， 必須提高激光的強(qiáng)度， 高強(qiáng)度的激光會(huì)使染料在連續(xù)掃描過程中迅速褪色。光毒作