龍川草骨痛顆粒質(zhì)量標準論文

1、龍川草骨痛顆粒質(zhì)量標準論文 【摘要】目的制定龍川草骨痛顆粒質(zhì)量控制標準。方法采用薄層色譜法對處方中乳香、沒藥、延胡索、牛膝、桂枝進行定性鑒別；采用高效液相色譜法對綠原酸進行含量測定，用以控制其質(zhì)量。結(jié)果HPLC法測定綠原酸可達基線分離，在濃度1.6221.60g時線性良好,回歸方程:A=2516409C-2979，r=1.0000，5次測定平均加樣回收率為98.7%,RSD為2.29%。結(jié)論該法可準確地進行定性、定量檢測，能有效地控制該制劑的質(zhì)量。 【關(guān)鍵詞】龍川草骨痛顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；綠原酸 StudyonQualityStandardofLongchuancaogutong

2、Granule Abstract：ObjectiveToestablishastandardforthequalitycontrolofLongchuancaogutongGranule.MethodsRamulusCinnamomi,RadixAchyranthisBidentatae,RuXiang,MoYaoandRhizomaCorydaliswereidentifiedbyTLC,andthecontrolofChlorogenicacidinCortexEucommiaewasdeterminedbyHPLC.ResultsThecalibrationcurvewaslineari

3、ntherangeof1.6221.60g(r=1.0000).Theaveragerecoveryofthemethodwas98.7%,RSDwas2.29%(n=5).ConclusionThismethodisreliableandaccurate,andcanbeusedforthequalitycontrolofthispreparation. Keywords：LongchuancaogutongGranule;TLC;HPLC;Chlorogenicacid 龍川草骨痛顆粒是由杜仲、乳香、沒藥、延胡索、牛膝、桂枝等15味藥材組成的復(fù)方制劑。具有補益肝腎、舒筋活絡(luò)、養(yǎng)血斂陰、止痛

4、消淤等功能，臨床上用于治療腰間盤突出、骨質(zhì)增生、頸椎病、風(fēng)濕以及類風(fēng)濕癥，療效滿意。處方中杜仲藥材所含的主要成分為綠原酸，綠原酸的含量測定方法，文獻報道有薄層掃描法1、紫外分光光度法2、高效液相色譜法3等。本實驗采用薄層色譜法對處方中桂枝、牛膝等五味藥材進行定性鑒別；采用了檢測靈敏度高、準確度及精密度好的高效液相色譜法，對處方中的綠原酸進行含量測定，用以控制其質(zhì)量。 1儀器與試藥 1.1儀器LC4A高效液相色譜儀；SPD2A紫外檢測器；CR3A積分儀；UV260紫外分光光度計（日本島津制作所）。 1.2試劑與藥品甲醇為色譜純；磷酸、石油醚、醋酸乙酯、氯仿、正己烷等其它試劑均為分析純。綠原酸對照

5、品（批號7539406中國藥品生物制品檢定所）。龍川草骨痛顆粒（由沈陽軍區(qū)沈陽制劑中心提供，批號20010612，20020620，20020623，20030314）。 2方法與結(jié)果 2.1鑒別 2.1.1桂枝定性鑒別桂枝其有效成分為脂溶性和水溶性兩部分，用蒸餾法提取揮發(fā)油，以桂皮醛作對照品，參考桂枝薄層色譜鑒別項下的色譜條件進行薄層鑒別，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙紅色斑點，分離效果好，經(jīng)陰性對照，陰性樣品無干擾，證明此方法具專屬性與可行性。 對照品溶液制備：取桂皮醛對照品，加乙醇制成每毫升含1l的溶液，作為對照品溶液。 陰性對照液制備：取去桂枝的本品細粉5g，加乙

6、醇10ml，浸泡20min，時時振搖，濾過，濾液作為陰性對照液溶液。 供試品溶液制備：取本品細粉5g，加乙醇20ml，加熱回流40min，濾過，濾液加入鹽酸2ml，加熱回流1h，后濃縮至約5ml，加水10ml，用石油醚（6090）20ml提取，提取液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。 測定法：照薄層色譜法4，吸取供試品溶液、陰性對照液各10l、對照品溶液2l，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（6090）醋酸乙酯（173）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色斑點。見圖1。 2.1.2牛膝定性鑒別牛膝含皂苷和脫皮甾

7、酮、牛膝甾酮、鉀鹽和黏液質(zhì)等。有散淤活血、消腫痛、補肝腎、強筋骨、降血壓等效用。其有效成分三匝皂苷，水解后皂元齊墩果酸，以齊墩果酸為對照品。使用乙醇，加熱回流提取并在鹽酸條件下，加熱回流將提取物水解，用甲醇制成供試品液，另使用氯仿甲醇（401）為展開劑。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，分離效果好，經(jīng)陰性對照，陰性樣品無干擾，證明此方法具專屬性與可行性。 對照品溶液制備：取齊墩果酸對照品，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，作為對照品溶液。 陰性對照液制備：取去牛膝的本品細粉5g，按供試品制備方法，依法操作，作為陰性對照液溶液。 供試品溶液制備：取本品細粉5g，加乙醇20

8、ml，加熱回流40min，濾過，濾液加入鹽酸2ml，加熱回流1h，后濃縮至約5ml，加水10ml，用石油醚（6090）20ml提取，提取液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。 測定法：照薄層色譜法4，吸取供試品溶液1015l、對照品溶液2l，分別點于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以氯仿：甲醇（401）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸試液，在110加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍色斑點。見圖2。 2.1.3乳香定性鑒別乳香中含樹脂、樹膠、揮發(fā)油。樹脂的主要成分為游離、-乳香脂酸、結(jié)合乳香脂酸、乳香樹脂烴；樹膠含阿糖酸、西黃芪膠

9、粘素；揮發(fā)油呈淡黃色，有芳香，含蒎烯、消旋檸檬烯及、-水芹烯。采用水蒸氣蒸餾收集揮發(fā)油，以藥材作對照，以石油醚（6090）：醋酸乙酯（855）為展開劑，進行二次展開，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，分離效果好，經(jīng)陰性對照，陰性樣品無干擾，證明此方法具專屬性與可行性。 對照品溶液制備：取乳香對照藥材0.5g，加乙醇10ml，超聲處理5min，濾過，濾液作為對照品溶液。 陰性對照液制備：取去乳香的本品細粉5g，按供試品制備方法，依法操作，作為陰性對照液溶液。 供試品溶液制備：取本品細粉10g，加乙醇10ml，超聲處理5min，濾過，濾液作為供試品溶液。 測定法：照薄層色

10、譜法4，吸取供試品溶液1015l、對照品溶液2l，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（6090）醋酸乙酯（855）為展開劑，展開3cm，取出，晾干，再以石油醚（6090）：醋酸乙酯（855）為展開劑，展開，取出，晾干，以碘蒸氣熏至斑點顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖3。 圖1桂枝的薄層色譜圖（略） 圖2牛膝的薄層色譜圖（略） 圖3乳香的薄層色譜圖（略） 2.1.4沒藥定性鑒別沒藥中含樹脂、樹膠、揮發(fā)油。樹脂的主要成分大部分為脂溶性，小部分為水溶性，含，-罕沒藥酸，沒藥尼酸，-罕沒藥酚；揮發(fā)油在空氣中易樹脂化，含丁香油酚、枯醛、蒎烯、桂皮

11、醛等；樹膠水解得阿拉伯糖、半乳糖和木糖。采用水蒸氣蒸餾收集揮發(fā)油，以藥材作對照，以石油醚（6090）醋酸乙酯（855）為展開劑，進行二次展開，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，分離效果好，經(jīng)陰性對照，陰性樣品無干擾，證明此方法具專屬性與可行性。 對照品溶液制備：取沒藥對照藥材0.5g，加乙醇10ml，超聲處理5min，濾過，濾液作為對照品溶液。 陰性對照液制備：取去沒藥的本品細粉5g，按供試品制備方法，依法操作，作為陰性對照液溶液。 供試品溶液制備：取本品細粉10g，加乙醇10ml，超聲處理5min，濾過，濾液作為供試品溶液。 測定法：照薄層色譜法4，吸取供試品溶液1

12、015l、對照品溶液2l，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（6090）：醋酸乙酯（855）為展開劑，展開3cm，取出，晾干，再以石油醚（6090）：醋酸乙酯（855）為展開劑，展開，取出，晾干，以碘蒸氣熏至斑點顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，見圖4。 2.1.5延胡索薄層色譜鑒別延胡索主要含生物堿，有延胡索甲素、乙素、丙素、丑素等。藥理實驗已證明，均有顯著的鎮(zhèn)痛、安定作用。有行氣活血、散淤止痛之功效。用于心腹腰膝諸痛、跌打損傷、淤血作痛等癥。以延胡索藥材為對照，使用氯仿提取，用甲醇制成供試品液，另使用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板，以

13、正己烷氯仿甲醇（7.541）為展開劑。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，分離效果好，經(jīng)陰性對照，陰性樣品無干擾，證明此方法具專屬性與可行性。 對照品溶液制備：取延胡索對照藥材0.5g，按供試品制備方法，依法操作，作為對照品溶液。 陰性對照液制備：取去延胡索的本品細粉5g，按供試品制備方法，依法操作，作為陰性對照液溶液。 供試品溶液制備：取本品細粉5g，加氯仿30ml，濃氨試液1ml，超聲處理30min，濾過，用硫酸（310）提取2次，15ml/次，合并酸提取液，用濃氨試液調(diào)pH910濾液作為供試品溶液。用氯仿提取2次，10ml/次，合并氯仿提取液，蒸干，殘渣加甲醇2m

14、l使溶解，作為供試品溶液。 測定法：照薄層色譜法4，吸取供試品溶液1015l、對照藥材溶液2l，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以正己烷氯仿甲醇（7.541）為展開劑，置已用展開劑飽和的層析缸內(nèi)，展開，取出，晾干，以碘蒸氣熏至斑點顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。在空氣中揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖5。 圖4沒藥的薄層色譜圖（略） 圖5延胡索的薄層色譜圖（略） 2.2龍川草骨痛顆粒中杜仲所含綠原酸的含量測定 2.2.1色譜分析條件

15、測定波長選擇：取綠原酸對照品，加50%甲醇溶解，制成每毫升含10g的溶液,紫外分光光度法掃描，光譜見圖6。從圖6中看出綠原酸在321nm處有最大吸收，故選擇321nm為測定波長。 圖6綠原酸對照品UV圖譜（略） 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18柱（4.6mm250mm,7m）；流速1ml/min；柱溫28;進樣量20l。 流動相的選擇：參照有關(guān)文獻，選擇甲醇-0.4%磷酸溶液(1585)為流動相，保留時間約為17min。 對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對照品5mg（實際稱樣為5.4mg）,置100ml量瓶中，加50%甲醇適量，超聲波處理10min，使對照品溶解，再加50%甲醇稀釋至

16、刻度，搖勻，作為對照品溶液（54g/ml）。 供試品溶液的制備：取本品裝量差異項下的粉末約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入氯仿液30ml，超聲處理2次，30min/次,棄去氯仿液，揮干，加甲醇30ml，超聲處理2次，30min/次,合并甲醇液，蒸干，殘渣加50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶內(nèi)，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。 2.2.2方法學(xué)考察 空白實驗：按處方量制備缺杜仲的陰性對照溶液，照文中所述含量測定方法操作，結(jié)果空白溶液與綠原酸對照品相同保留時間處，未顯示明顯色譜峰，認為無干擾，見圖7。 圖7龍川草骨痛顆粒的HPLC圖（略） 樣品溶液穩(wěn)定性實驗：將待測樣品溶液，置室溫下貯存，分別

17、于0，0.5，1，2，3，5h,定期測定含量。結(jié)果6次含量的RSD為0.48%,表明樣品溶液基本穩(wěn)定。 儀器的精密度實驗：精密吸取上述對照品溶液（54g/ml）20l，重復(fù)進樣6次，結(jié)果RSD為0.41%，精密度實驗符合要求。 重復(fù)性實驗：取同一批號的供試品，分別進行供試品溶液的制備、測定，重復(fù)5次，結(jié)果RSD為1.34%。 線性關(guān)系的考察：精密量取綠原酸對照品溶液0.30，0.50，1.00，1.50，2.00和4.00ml，分別置于10ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻。取20l注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，相應(yīng)濃度為橫坐標，進行線性回歸，線性方程：A=2516409C

18、-2979，r=1.0000。 加樣回收率實驗：精密稱取已知含量的同一批龍川草骨痛顆粒（20010612）1g,精確加入綠原酸對照品適量,按文中供試品溶液的制備方法操作,測定其含量,并計算回收率。結(jié)果見表1。 表1加樣回收率實驗（略） 2.2.3樣品測定取本品裝量差異項下的粉末約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入氯仿液30ml，超聲處理2次，30min/次,棄去氯仿液，揮干，加甲醇30ml，超聲處理2次，30min/次,合并甲醇液，蒸干，殘渣加50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶內(nèi)，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。精密稱取綠原酸對照品5mg,置100ml量瓶中，加50%甲醇適量，超聲波處理10min，使對照品溶解，再加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別吸取對照品溶液與供試品溶液各20l，注入液相色譜儀，測定，計算，即得。 本品每袋含杜仲以綠原酸（C16H18O9）計，不得少于1mg。 取本品樣品3批，按上法測定。結(jié)果見表2。 表2龍川草骨痛顆粒樣品測定結(jié)果（略） 3討論 3.1提取方法、提取溶劑的選擇分別選用甲醇、乙醇為提取溶劑，超聲波處理30min，結(jié)果甲醇提取量大于乙醇。因此選擇甲醇為提取溶劑。 3.2色譜條件的選擇在本項實驗中，我們參考文獻，采用了甲醇與磷酸水的配比，而沒有采用緩沖液作為流動相，有利于色譜柱的長期