食品添加劑乳鐵蛋白的質(zhì)量規(guī)格要求、生產(chǎn)使用工藝和檢驗(yàn)方法食品中該添加劑的檢驗(yàn)

1、資料四乳鐵蛋白食品添加劑的質(zhì)量規(guī)格要求、生產(chǎn)使用工藝和檢驗(yàn)方法，食品中該添加劑的檢驗(yàn)方法或相關(guān)情況說(shuō)明內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司一、乳鐵蛋白質(zhì)量規(guī)格要求（一）感官指標(biāo)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法色澤淡粉紅色粉末。取5克被測(cè)樣品置于一潔凈的白色搪瓷皿中，在自然光線下用肉眼觀察其色澤和外觀形態(tài)及其滋氣味。滋氣味具本產(chǎn)品特有的味道，無(wú)異味組織狀態(tài)均勻、細(xì)密粉末，無(wú)吸潮、無(wú)結(jié)塊。正常視力下無(wú)可見(jiàn)雜質(zhì)。（二）理化指標(biāo)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法總蛋白質(zhì)95.0gb 5009.5-2010乳鐵蛋白占總蛋白的比例90%見(jiàn)本節(jié)“二、檢驗(yàn)方法”水分8.00gb 5009.3-2010灰分5.00gb 5009.4-2010鐵飽和度

2、5-20%見(jiàn)本節(jié)“二、檢驗(yàn)方法”ph4.5-6.8檢測(cè)2%水溶液在20下的ph顆粒度要求40目篩分通過(guò)率85%標(biāo)準(zhǔn)篩檢測(cè)50目篩分通過(guò)率50%溶解度完全溶解，無(wú)肉眼溶物取0.2克乳粉，置于50、200 ml水中，充分?jǐn)嚢?分鐘以上，靜止后觀察。（三）微生物、污染物及真菌毒素指標(biāo)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法菌落總數(shù)（cfu/g）1000gb 4789.2-2010 大腸菌群（cfu/g）10gb 4789.3-2010平板計(jì)數(shù)法金黃色葡萄球菌（cfu/g）10gb 4789.10-2010平板計(jì)數(shù)法酵母和霉菌（cfu/g）50gb 4789.15-2010阪崎腸桿菌（cfu/g）0/100ggb 4789.

3、40-2010沙門(mén)氏菌（cfu/g）0/25ggb 4789.4-2010鉛（mg/kg）0.15gb 5009.12-2010砷（mg/kg）0.2gb/t 5009.11-2003黃曲霉毒素m1（g/kg）0.5gb 5009.24-2010二、檢驗(yàn)方法（一）用反相高效液相層析法測(cè)定乳鐵蛋白的純度1. 樣品準(zhǔn)備對(duì)粉狀乳鐵蛋白，稱出20 mg乳鐵蛋白樣品，用milliq水配成20 ml，1 mg/ml的乳鐵蛋白溶液，再通過(guò)0.2 m的乙酸纖維素膜進(jìn)行過(guò)濾。2. 材料和試劑（1）milliq水（超純水18 megohm resistivity）（2）95%的乙腈(氰化甲烷)（hplc 級(jí)）（3

4、）1%的三氟乙酸（tfa）2.1 緩沖液準(zhǔn)備（1）緩沖液a：100% milliq水把1 l milliq水裝在1 l 的schott瓶中。（2）緩沖液b：95%的乙腈分別量取50 ml milliq水和950ml乙腈。把二者混合，通過(guò)0.45 m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。儲(chǔ)存在1 l的schott瓶中。（3）緩沖液c：1%的三氟乙酸用移液管量取25 ml三氟乙酸放入200 ml milliq水中，用milliq水補(bǔ)至250 ml。轉(zhuǎn)移到250 ml的schott瓶中儲(chǔ)存。3. 儀器設(shè)備（1）水基線體系控制和獲得數(shù)據(jù)的設(shè)備（empower）（2）水2695分離組件和2487雙吸收檢測(cè)器（3）反相高效液相

5、層析柱-alltech prosphere c4 300a 150mm 4.6mm, with alltech all-guard guard 7.5 4.6mm.4. 高效液相層析的測(cè)量方法4.1 注射體積50 l已過(guò)濾的乳鐵蛋白樣品或空白液注入柱中供分析。4.2 梯度表時(shí)間（min）流速（ml/min）成分曲線% a% b% c0.001.073.316.71010.001.0355510611.001.0187210613.001.0187210615.001.073.316.71064.3 溫度柱子溫度=35c樣品溫度=10c4.4 檢測(cè)在波長(zhǎng)280 nm處檢測(cè)乳鐵蛋白，乳鐵蛋白的洗脫

6、時(shí)間大約9.7分鐘。5. 過(guò)程與計(jì)算5.1 用empower軟件，用樣品的層析譜減去空白溶液。5.2 結(jié)合整個(gè)樣品的層析譜，算出全部蛋白的含量。然后結(jié)合乳鐵蛋白的高峰區(qū)算出乳鐵蛋白的百含量（以蛋白質(zhì)為基數(shù)）。5.3 用下面的計(jì)算公式計(jì)算乳鐵蛋白的百分含量（干重）：乳鐵蛋白的百分含量(干重)=蛋白含量/(100 - 水分)乳鐵蛋白的百分含量其中：蛋白含量是用凱氏定氮法測(cè)定的蛋白含量乳鐵蛋白的百分含量是用高效液相層析法測(cè)定的乳鐵蛋白含量（二）乳鐵蛋白鐵飽和度的測(cè)定1. 原理通過(guò)向乳鐵蛋白水溶液中逐漸加入等分量的三價(jià)鐵離子溶液直至乳鐵蛋白鐵飽和。該過(guò)程中乳鐵蛋白鐵飽和度的變化在465 nm分光光度計(jì)

7、下進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)吸光值不再變化的時(shí)候說(shuō)明乳鐵蛋白已經(jīng)完全飽和。2. 試劑2.1 fecl3.6h2o2.2 nta (氨三乙酸)2.3 nah2po4.h2o2.4 na2hpo4.12h2o2.5 nahco32.6 naoh 2.7 nacl3. 溶液的配置3.1 配置含有10 mm氯化鐵和 0.1 m hcl的溶液：（1）在100 ml容量瓶中分別加入：- 0.83 ml 37%的hcl- 0.270 g的fecl3.6h2o (準(zhǔn)確稱量)（2）加蒸餾水至100 ml刻度處3.2 配置40 mm na-nta溶液：在100 ml容量瓶中分別加入:- 0.764 g的nta- 加入大約20

8、ml去離子水- 緩慢加入1 m的naoh溶液來(lái)溶解nta粉末(以形成可溶的nta鈉鹽)- 將1m的naoh逐滴加入，每加入一滴并充分混合直至nta完全溶解3.3 配置含有5mm fecl3.6h2o和20 mm nanta的溶液 - 將等量（各20 ml）的3.1和3.2溶液混合- 用10 m的naoh溶液將溶液的ph值調(diào)至4-6之間（例如：4.5），但要注意盡可能少的將溶液稀釋）3.4 0.1m nahco3的配置將8.401 g的nahco3加入1升蒸餾水中。3.5 2%乳鐵蛋白水溶液的配置- 將0.8 g乳鐵蛋白粉末溶解于40 ml蒸餾水中- 攪動(dòng)直至完全溶解4. 鐵飽和度的測(cè)量可以用所

9、配置溶液來(lái)測(cè)定ph值和在600 nm時(shí)的透光率，溶液必須經(jīng)過(guò)0.45 m millipore過(guò)濾器過(guò)濾- 將1ml乳鐵蛋白溶液注入比色皿- 加入1.5 ml 0.15m nacl和200 l的0.1 m的nahco3溶液- 在465 nm下測(cè)量溶液的吸光值- 加入10 l等量的溶液3.3。每加一次，充分混合并在465 nm下測(cè)量吸光值，直到吸光值變?yōu)楹愣ǎ簿褪钦f(shuō)乳鐵蛋白趨于飽和。5. 結(jié)果的表達(dá)以縱坐標(biāo)為吸光值，橫坐標(biāo)為等量三價(jià)鐵離子濃度作圖。直線(1)為當(dāng)乳鐵蛋白趨于飽和時(shí)的吸光值。直線(2)為以初始乳鐵蛋白吸光值為原點(diǎn)到鐵飽和時(shí)吸光值的連線。將直線(2)反向延長(zhǎng)使其與橫坐標(biāo)交匯。乳鐵蛋白

10、初始鐵飽和度可以通過(guò)以下兩種方法計(jì)算得出：（1）通過(guò)465 nm下最初的吸光值(b1)與飽和時(shí)溶液的吸光值(b2)的比值計(jì)算得出：（2）通過(guò)初始乳鐵蛋白中三價(jià)鐵離子的微摩爾數(shù)(a1)和飽和乳鐵蛋白中三價(jià)鐵離子的微摩爾數(shù)(a)的比值得出：備注：一等份也就是每10 l的三價(jià)鐵離子溶液=0.05 mol fe3+6. 乳鐵蛋白濃度測(cè)定考慮到1 mol的乳鐵蛋白可以結(jié)合2摩爾的三價(jià)鐵離子，因此溶液中乳鐵蛋白的摩爾數(shù)應(yīng)該是鐵離子摩爾數(shù)的二分之一。mol乳鐵蛋白= 0.5mol fe3+乳鐵蛋白分子量= 77,000因此，77,000mol乳鐵蛋白10-6= 檢測(cè)溶液中乳鐵蛋白的質(zhì)量（g）。（三）乳制品中

11、乳鐵蛋白含量的檢測(cè)第一部分 高效毛細(xì)管電泳測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白含量a.1 適用范圍本方法適用于乳粉和乳鐵蛋白原料中乳鐵蛋白的定性和定量分析。a.2 原理試樣經(jīng)處理后進(jìn)入毛細(xì)管中，在毛細(xì)管中充入緩沖溶液，兩端加高電壓，毛細(xì)管中形成電場(chǎng)。樣品中帶電粒子在電場(chǎng)中以不同速度運(yùn)動(dòng)，流經(jīng)檢測(cè)器被檢測(cè)，得到分離譜圖，根據(jù)峰面積和濃度成正比的關(guān)系，計(jì)算不同成分的含量。a.3 試劑a.3.1 實(shí)驗(yàn)配制所用水均為超純水。a.3.2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（fluka）。a.3.3 氫氧化鈉：1 mol/l溶液。a.3.4 硼酸（sigma）。a.3.5 csoh（50 %水溶液，北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司）。a.3.6

12、冰乙酸（優(yōu)級(jí)純）。a.3.7 十二烷基硫酸鈉(sds，sigma-aldrieh，貨號(hào):l3771)。a.3.8 羥乙基纖維素(hec，sigma-aldrieh，貨號(hào):54290)。a.3.9 hec儲(chǔ)備液的配制： hec是一種淡黃色粉末狀固體，首先準(zhǔn)確量取100 ml超純水置于試劑瓶中，將其放置在60 水浴中加熱，將準(zhǔn)確稱量的4 g hec逐步加入，渦旋混勻，待其完全溶解即配制成40 g/l的hec儲(chǔ)備液，放入4 冰箱備用。a.3.10 運(yùn)行緩沖液：0.3 mol/l硼酸，其中含20 mmol/l sds和8 g/l hec。首先分別準(zhǔn)確稱取1.855 g硼酸和0.577 g sds放入1

13、00 ml容量瓶中，加入70 ml的超純水，超聲使其溶解，然后再加入20 ml質(zhì)量濃度為40 g/lhec儲(chǔ)備液，渦旋混勻后用1 mol/l的csoh調(diào)節(jié)ph值到8.80，最后用超純水定容到刻度線，室溫放置備用。a.3.11 樣品緩沖液：0. 05 mol /l hac。準(zhǔn)確移取 1.437 ml冰醋酸置于500 ml容量瓶中，用超純水定容到刻度，放入4 冰箱備用。a.4 儀器a.4.1 毛細(xì)管電泳儀（帶有紫外檢測(cè)器）。a.4.2 電子天平。a.4.3 ph計(jì)。a.4.4 超聲振蕩器。a.4.5 高速離心機(jī)a.5 操作步驟a.5.1 樣品的前處理分別稱取一定質(zhì)量的的樣品于10 ml容量瓶中，加

14、入適量樣品緩沖液，渦旋混勻后，再用樣品介質(zhì)稀釋定容到刻度，于9000 r/min離心10 min，取上清液分析。a.5.2 測(cè)定a.5.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取10 mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于l ml樣品管中，加入1.5 ml樣品介質(zhì)渦旋混勻后，制得10000 mg/l的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放入4 冰箱備用。工作液由儲(chǔ)備液經(jīng)0. 05 mol/l hac 稀釋后制得。準(zhǔn)確移取10、20、40、80、160 mg/l質(zhì)量濃度為 5000 mg/l的lf標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于l ml樣品管中，再分別加入990、980、960、920、840 mg/l樣品緩沖液，混勻后即得50、100、200、400、800

15、mg/l的工作液。峰面積(a)與質(zhì)量濃度(c，mg/l)在50800 mg/l范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，檢出限(lod)為15 mg/l。a.5.2.2 試樣測(cè)定測(cè)定條件 毛細(xì)管(50 um57 cm，有效長(zhǎng)度:50 cm，河北永年銳灃色譜配件有限公司)；分離電壓:20kv；檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm；操作溫度:25 ；進(jìn)樣壓力：0.5 psi；進(jìn)樣時(shí)間:20 s。每次實(shí)驗(yàn)完畢后，用運(yùn)行緩沖溶液洗3 min，用1 mol/l氫氧化鈉洗10-30 min，水洗3 min，抬高蓋板使冷凝液回流后，關(guān)機(jī)。使用新?lián)Q的毛細(xì)管柱需要用水洗10 min，用1 mol/l氫氧化鈉清洗30 min，水洗10 min，

16、進(jìn)行柱子的活化。然后可以進(jìn)行樣品的測(cè)定。(清洗壓力均為20 psi)a.6 分析結(jié)果的計(jì)算計(jì)算公式: x = c * n/m 式中：x樣品中乳鐵蛋白的含量mg/kg；c從標(biāo)曲中查得相應(yīng)乳鐵蛋白的含量mg/l；m稱取試樣的質(zhì)量g；n稀釋倍數(shù)定容體積。第二部分 酶聯(lián)免疫法a.7 原理本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（elisa）。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本加入到預(yù)先包被牛乳鐵蛋白（lf）單克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分，再加入酶標(biāo)工作液，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物a、b，底物（tmb）在辣根過(guò)氧化物酶（hrp）催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，在酸的作用

17、下變成黃色，顏色的深淺與樣品中牛乳鐵蛋白（lf）濃度呈正相關(guān)，450nm波長(zhǎng)下測(cè)定od值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的od值，計(jì)算樣本中牛乳鐵蛋白（lf）含量。a.8 試劑盒組成及試劑配制a.8.1 酶聯(lián)板：一塊（96孔）a.8.2 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1 ml，蓋好后靜置10 min以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為100 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成100 ng/ml,50 ng/ml,25 ng/ml,12.5 ng/ml,6.25 ng/ml,3.12 ng/ml,1.56 ng/ml其原液直接作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 n

18、g/ml，臨用前15 min內(nèi)配制。如配制15 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5 ml 100 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5 ml樣品稀釋液的eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推.a.8.3 樣品稀釋液:120 ml/瓶。a.8.4 檢測(cè)稀釋液a：110 ml/瓶。a.8.5 檢測(cè)稀釋液b：110 ml/瓶。a.8.6 檢測(cè)溶液a：1120 l/瓶（1:100）臨用前以檢測(cè)稀釋液a1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100 l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.10.2 ml。如1 l檢測(cè)溶液a 加99 l檢測(cè)稀釋液a的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配

19、制。a.8.7 檢測(cè)溶液b：1120 l/瓶（1:100）臨用前以檢測(cè)稀釋液a1:100稀釋，稀釋方法同檢測(cè)溶液a。a.8.8 底物溶液: 110 ml/瓶.a.8.9 濃洗滌液:130 ml/瓶。使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。a.8.10 終止液：110 ml/瓶（1 mol/l h2so4）。a.9 儀器和設(shè)備a.9.1 37 恒溫箱。a.9.2 酶標(biāo)儀。a.9.3 精密移液器及一次性吸頭。a.9.4 蒸餾水。a.9.5 一次性試管。a.9.6 吸水紙。a.9.7 ph計(jì)。a.9.8 離心機(jī)。a.9.9 冰箱。a.10 分析步驟a.10.1 試樣處理稱取10 g乳粉與三角瓶中，先用40 左

20、右溫水30 ml溶劑樣品后調(diào)ph4.6后轉(zhuǎn)入50 ml容量瓶中定容。將容量瓶放入4 冰箱中1 h，取出于4000 r/min 離心10 min，取上清液備用。a.10.2 試劑盒操作步驟a.10.2.1 準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30 min。a.10.2.2 配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。a.10.2.3 加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50 l；待測(cè)樣本孔中先加入待測(cè)樣本10 l，再加樣本稀釋液40 l（即樣本稀釋5倍）；空白對(duì)照孔不加。a.10.2.4

21、溫育：37 水浴鍋或恒溫箱溫育30 min。a.10.2.5 洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說(shuō)明書(shū)操作洗板）。a.10.2.6 加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50 l，空白對(duì)照孔不加。a.10.2.7 溫育：37 水浴鍋或恒溫箱溫育30 min。a.10.2.8 洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說(shuō)明書(shū)操作洗板）。a.10.2.9 顯色：每孔先加入顯色劑a 液50 l，再加入顯色劑b液 50 l，平板混勻器混勻30 s（或用手輕輕震蕩混勻30 s），37 避光顯色15 min。a.10.2.10 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在終止后15 min內(nèi)，用450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值（o