最新第七章1固定化細胞和酶1PPT文檔

1、 酶催化劑的優(yōu)點：酶催化劑的優(yōu)點： 專一性強，專一性強， 反應條件溫和，反應條件溫和， 反應速度較快。反應速度較快。 弱點：弱點： 溶液酶在反應后，分離困難，重復利用困難；溶液酶在反應后，分離困難，重復利用困難； 溶液酶穩(wěn)定性差，易失活。溶液酶穩(wěn)定性差，易失活。 19691969出現(xiàn)了固定化酶技術。出現(xiàn)了固定化酶技術。 固定化酶就是把原來游離的水溶性酶，設法限制固定化酶就是把原來游離的水溶性酶，設法限制 或固定于某一或固定于某一 局部的空間或者固定于載體上。局部的空間或者固定于載體上。固定化酶生物反應器固定化酶生物反應器 實際應用中，固定實際應用中，固定化酶可以裝在反應化酶可以裝在反應器中，連

2、續(xù)生產(chǎn)有器中，連續(xù)生產(chǎn)有利于生產(chǎn)的自動化，利于生產(chǎn)的自動化，提高生產(chǎn)率。提高生產(chǎn)率。 鑒于此，鑒于此，70年代以年代以來，該技術受到各來，該技術受到各國學者的矚目，紛國學者的矚目，紛紛開展固定化酶的紛開展固定化酶的研究研究。8.18.1 固定化方法及固定化后酶和固定化方法及固定化后酶和細胞的性質細胞的性質 一、一、 固定化的原則和方法固定化的原則和方法 由于酶催化作用依靠它的由于酶催化作用依靠它的高級結構高級結構及及活性中心活性中心。 固定化時，活性中心的固定化時，活性中心的必需基團避免參加反應必需基團避免參加反應； 避免避免高溫、強堿、有機溶劑高溫、強堿、有機溶劑以及以及高濃度鹽高濃度鹽的處

3、理，的處理，保護保護靠氫鍵、離子鍵、疏水鍵等弱鍵維系的酶蛋靠氫鍵、離子鍵、疏水鍵等弱鍵維系的酶蛋白質的白質的高級結構高級結構。盡可能在。盡可能在溫和條件溫和條件下進行固定下進行固定化反應?；磻?。 固定化方法固定化方法： 載體結合法載體結合法：將酶（細胞）固定在不溶：將酶（細胞）固定在不溶性載體上?？抗矁r結合、離子結合、和性載體上?？抗矁r結合、離子結合、和物理吸附。物理吸附。常用的載體常用的載體：纖維素、葡聚糖、瓊脂糖：纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等多糖衍生物顆?；蚨嗫撞ＡУ取５榷嗵茄苌镱w?；蚨嗫撞ＡУ?。載體結合法載體結合法交聯(lián)法交聯(lián)法包埋法包埋法8.18.1 固定化方法及固定化后酶和細胞的的性質

4、固定化方法及固定化后酶和細胞的的性質 交聯(lián)法交聯(lián)法：使酶與具有兩個以上官能：使酶與具有兩個以上官能團的試劑（戊二醛）進行反應，應團的試劑（戊二醛）進行反應，應用化學鍵把酶固定用化學鍵把酶固定。 包埋法包埋法：將酶包在凝膠微小格子內，：將酶包在凝膠微小格子內，或是將酶包裹在半透性聚合物膜內的或是將酶包裹在半透性聚合物膜內的固定化方法。固定化方法。常用的凝膠常用的凝膠為聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、為聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、膠原、卡拉膠等。膠原、卡拉膠等。包埋法簡單，可適用于大多數(shù)酶包埋法簡單，可適用于大多數(shù)酶。二、二、 固定化酶和細胞的性質固定化酶和細胞的性質 1 1、固定化后的活性固定化后的活性 酶經(jīng)固

5、定化后，活力降低。酶經(jīng)固定化后，活力降低。 原因是原因是： a.a. 酶和載體結合時，活性中心的氨基酸也或酶和載體結合時，活性中心的氨基酸也或多或少地參與了結合多或少地參與了結合 ，使得酶的結構發(fā)生部，使得酶的結構發(fā)生部分變化，酶活力有一部分喪失。分變化，酶活力有一部分喪失。 b.b. 由于載體的存在，有空間位阻，影響底物由于載體的存在，有空間位阻，影響底物和酶接觸，酶的活性得不到全部表達。和酶接觸，酶的活性得不到全部表達。 細胞固定化后，一般酶活力不下降。細胞內酶細胞固定化后，一般酶活力不下降。細胞內酶受細胞膜、壁的保護。受細胞膜、壁的保護。8.18.1 固定化方法及固定化后酶和細胞的的性質

6、固定化方法及固定化后酶和細胞的的性質固定化酶結構的改變固定化酶結構的改變 2 2、穩(wěn)定性、穩(wěn)定性 酶或細胞被固定化后，由于載體的酶或細胞被固定化后，由于載體的存在，酶分子的存在，酶分子的結構或細胞被約束結構或細胞被約束，對外部惡劣環(huán)境的對外部惡劣環(huán)境的敏感性下降，使敏感性下降，使其穩(wěn)定性增加其穩(wěn)定性增加（對熱、對各種化學（對熱、對各種化學試劑等）。而且有時穩(wěn)定性增加的試劑等）。而且有時穩(wěn)定性增加的幅度比較大。幅度比較大。3 3、催化活性、催化活性 （底物專一性，反應的（底物專一性，反應的phph值，值，t t，動力學常數(shù)）動力學常數(shù)）a.a. 底物專一性底物專一性：當?shù)孜餅榇蠓肿訒r，酶或細：當

7、底物為大分子時，酶或細胞對底物專一性下降；當?shù)孜餅樾》肿訒r，胞對底物專一性下降；當?shù)孜餅樾》肿訒r，酶或細胞對底物專一性變化不大。酶或細胞對底物專一性變化不大。 b b最適最適phph：依固定化載體與酶分子、細胞上依固定化載體與酶分子、細胞上所分布電荷的相互作用不同而異。有的變化，所分布電荷的相互作用不同而異。有的變化，有的不變化，有的向有的不變化，有的向phph小的方向移動，有的小的方向移動，有的向向phph大的方向移動。大的方向移動。3 3、催化活性、催化活性 （底物專一性，反應的（底物專一性，反應的phph值，值，t t，動力學常數(shù)）動力學常數(shù)） c.c.反應的反應的最適溫度最適溫度 固定

8、化酶、細胞的最適溫度往往升高，固定化酶、細胞的最適溫度往往升高，升高的幅度不同，升高的幅度不同，215215 o oc c不等。不等。d.d.動力學常數(shù)動力學常數(shù) 酶：米氏常數(shù)酶：米氏常數(shù)kmkm反映了酶和底物的親和力。反映了酶和底物的親和力。固定化酶的表現(xiàn)固定化酶的表現(xiàn)km(app)km(app)與游離酶的與游離酶的kmkm相比相比有些不變，有的變化很大。有些不變，有的變化很大。3 3、催化活性、催化活性 （底物專一性，反應的（底物專一性，反應的phph值，值，t t，動力學常數(shù)）動力學常數(shù)） 原因可能是原因可能是：載體間的靜電作用，以及擴：載體間的靜電作用，以及擴散效應。如果固定化酶區(qū)域的

9、散效應。如果固定化酶區(qū)域的底物濃度比底物濃度比外部液相主體溶液高外部液相主體溶液高，km(app)km(app)下降。相反，下降。相反，用包埋法的固定化酶的用包埋法的固定化酶的km(app)km(app)值，可較游值，可較游離酶多兩個數(shù)量級。這是由于凝膠中的離酶多兩個數(shù)量級。這是由于凝膠中的擴擴散效應使底物濃度減少，散效應使底物濃度減少，導致內部底物濃導致內部底物濃度低于外部區(qū)域的濃度，度低于外部區(qū)域的濃度，km(app)km(app)上升。上升。 對于固定化細胞，情況類似。對于固定化細胞，情況類似。 vmax vmax 一般不變化。一般不變化。8.2 8.2 固定化酶和固定化細胞的應用固定化

10、酶和固定化細胞的應用 在在7070年代初，首先固定年代初，首先固定單一的酶單一的酶，催化單一，催化單一反應；反應； 隨后同隨后同時固定兩種酶或兩種以上的酶時固定兩種酶或兩種以上的酶，以及，以及固定化酶和輔酶，催化復雜一些的反應；固定化酶和輔酶，催化復雜一些的反應； 再后來發(fā)展起來的固定化細胞技術，使得不再后來發(fā)展起來的固定化細胞技術，使得不易提取的不穩(wěn)定的酶的利用有了方便條件，易提取的不穩(wěn)定的酶的利用有了方便條件，還可以還可以利用活細胞的完整代謝體系來完成復利用活細胞的完整代謝體系來完成復雜的反應。雜的反應。如乙醇的生產(chǎn)。如乙醇的生產(chǎn)。8.2 8.2 固定化酶和固定化細胞的應用固定化酶和固定化

11、細胞的應用 在固定化酶、固定化細胞的研究中發(fā)展在固定化酶、固定化細胞的研究中發(fā)展起來的起來的親和層析技術親和層析技術，已經(jīng)遠遠超出了已經(jīng)遠遠超出了 利用酶和微生物進行催化反應的范疇。利用酶和微生物進行催化反應的范疇。例如抗體抗原的提純是利用了特異的免例如抗體抗原的提純是利用了特異的免疫吸附反應。疫吸附反應。 固定化酶和細胞技術的顯著特點固定化酶和細胞技術的顯著特點： 1 1連續(xù)反應；連續(xù)反應； 2 2獲得的產(chǎn)物純度高；獲得的產(chǎn)物純度高； 3 3固定化酶或細胞可重復使用，減少固定化酶或細胞可重復使用，減少 了浪費；了浪費； 4 4易實現(xiàn)自控易實現(xiàn)自控。應用實例：應用實例： dl-dl-氨基酸的光

12、學拆分氨基酸的光學拆分 人體只能利用人體只能利用l-l-氨基酸，所以氨基酸，所以l-l-氨基酸氨基酸在食品醫(yī)藥領域的應用非常廣泛，并且在食品醫(yī)藥領域的應用非常廣泛，并且需要量不斷增加。需要量不斷增加。 化學合成法是生產(chǎn)氨基酸的方法之一，化學合成法是生產(chǎn)氨基酸的方法之一，該法成本低，但生產(chǎn)出來的氨基酸是該法成本低，但生產(chǎn)出來的氨基酸是dl dl 外消旋體。要想把外消旋體。要想把l-l-氨基酸分離出來，氨基酸分離出來，需要進行光學拆分。需要進行光學拆分。 復習幾個概念：復習幾個概念： 外消旋體外消旋體：對映體的右旋體和左旋：對映體的右旋體和左旋體等量混合后，它們的旋光性相互體等量混合后，它們的旋光

13、性相互抵消，不再有旋光性。這樣的混合抵消，不再有旋光性。這樣的混合物稱為外消旋體，以物稱為外消旋體，以d、l表示。外表示。外消旋體可以用適當方法拆開或分開。消旋體可以用適當方法拆開或分開。復習幾個概念：復習幾個概念： 外消旋化外消旋化：在一般情況下，和不對稱碳在一般情況下，和不對稱碳原子相連的四個原子或原子團，不能隨原子相連的四個原子或原子團，不能隨意調換位置，因此對映體不能相互轉換，意調換位置，因此對映體不能相互轉換，旋光度維持不變。旋光度維持不變。 但在熱、光、或者化學試劑的影響下，但在熱、光、或者化學試劑的影響下，不對稱碳原子上的原子或原子團可發(fā)生不對稱碳原子上的原子或原子團可發(fā)生調換現(xiàn)

14、象，使旋光物質轉化為它的對映調換現(xiàn)象，使旋光物質轉化為它的對映體，最后得到外消旋體體，最后得到外消旋體，原來，原來100%的左的左旋體，經(jīng)變化后，變成旋體，經(jīng)變化后，變成50%左旋體和左旋體和50%的右旋體，這種現(xiàn)象稱為外消旋化。的右旋體，這種現(xiàn)象稱為外消旋化。 dl-dl-氨基酸光學拆分中，以酶法最佳，它氨基酸光學拆分中，以酶法最佳，它是利用酰化氨基酸水解酶，制備純度高是利用?；被崴饷?，制備純度高的的l-aal-aa，且收率高且收率高。 氨基酰化氨基?；痚dl-r-chcooh + h2o l-r-ch-cooh + d-r-chcooh 不對稱水解不對稱水解 nh2 nh2 nhco

15、r 溶解度小溶解度小酰化?；?dl-aa l-aa ?；；痙-aa 外消旋化外消旋化外消旋體外消旋體固定化酶光學拆分固定化酶光學拆分dl-dl-氨基酸生產(chǎn)流程氨基酸生產(chǎn)流程 19691969年，日本千鈿一郎成功地利用固年，日本千鈿一郎成功地利用固定化?；被崴饷?，由?；ɑ；被崴饷?，由酰化- -dl-dl-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)氨基酸連續(xù)生產(chǎn)l-aal-aa獲得成功。獲得成功。 這是這是世界上世界上固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上應固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上應用的用的第一個實例第一個實例。各種光學活性氨基。各種光學活性氨基酸都用這種方法生產(chǎn)。該項技術成功酸都用這種方法生產(chǎn)。該項技術成功的關鍵是制造出適合于工業(yè)化要求的的關鍵是制造出適合于工業(yè)化要求的固定化酶。固定