純豬糞堆肥發(fā)酵菌的分離、鑒定及效能比對

1、純豬糞堆肥發(fā)酵菌的分離、鑒定及效能比對摘 要：為了篩選出能直接用于新鮮純豬糞堆肥發(fā)酵的功能菌，從發(fā)酵豬糞中分離出8株可能對豬糞發(fā)酵有促進(jìn)作用的菌株，對其進(jìn)行16s rdna分子生物學(xué)鑒定及同源性分析，確定其為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、腸桿菌屬、包特氏菌屬、擬諾卡氏菌屬、微桿菌，分屬于5個屬、6個種。研究各菌應(yīng)用于純豬糞堆肥的催腐熟效果。結(jié)果表明：枯草芽孢桿菌和腸桿菌屬可提高堆體發(fā)酵溫度，增加高溫持續(xù)時間（50）、降低腐熟后堆體水分含量，降低堆體發(fā)酵初期的ph值，增加全氮相對含量，加快c/n比的下降速度，促進(jìn)堆肥腐熟進(jìn)程，可作為純豬糞堆肥發(fā)酵的優(yōu)良菌種；地衣芽孢桿菌提高堆體發(fā)酵溫度，降低腐熟后

2、堆體水分含量，加快c/n比的下降速度，但需在堆肥初期適當(dāng)降低堆體溫度，以提高其堆肥功效；擬諾卡氏菌屬提高了堆體發(fā)酵溫度，降低了堆體的水分含量，可作為純豬糞發(fā)酵菌的輔助菌種使用；包特氏菌屬和微桿菌可以提高堆體發(fā)酵溫度，但其余各指標(biāo)未見有明顯的優(yōu)勢，故不建議作為純豬糞發(fā)酵菌使用。關(guān)鍵詞：堆肥 16s rdna 鑒定 豬糞 細(xì)菌isolation,identification and effectiveness comparison of composting pure swinemanure fermentation microorganismabstract: in order to scree

3、n the strain that can be applied in pure swine manure composting,eight strains,which can grow in swine manure medium,have been separated from composting manure.those isolated strains were preliminary identified into 5genera,6 strains by applying the method of 16s rdna molecular identifications,those

4、 strains were bacillus subtilis,enterobacter sp.,bacillus licheniformis, bordetella petrii, nocardiopsis sp, microbacterium sp.the maturity indices of composting pure swine manure inoculating those strains were investigated respectively, the results show that inoculating strains bacillus subtilis an

5、d enterobacter sp. could enhance the fermentation temperature at the initial stage, enhance duration time of high temperature( 50 ) and content of total nitrogen(t-n),reduce moisture and c/n ratios ,also initial ph value, promote composting process, they are the good bacteria to fermented pure swine

6、 manure;inoculating strain bacillus licheniformis could enhance the fermentation temperature, reduce moisture and c/n ratios,but it must to be reduced the fermentation temperature appropriately during composting at the initial stage to enhance the effectiveness of composting.also inoculating strain

7、nocardiopsis sp. could enhance the fermentation temperature, reduce the moisture ratio, so it could be applied as an auxiliary fermenting bacteria.though inoculating strains nocardiopsis sp.and microbacterium sp. could enhance fermentation temperature, but no significant difference with other maturi

8、ty indices, not recommended for using as fermenting bacteria.key words:composting; 16s rdna; identification;swine manure ;bacteria 基金項目：福建省科技廳星火計劃“閩北山區(qū)沼氣工程循環(huán)經(jīng)濟(jì)模式構(gòu)建與示范”（2009s0048）；福建省農(nóng)科院創(chuàng)新團(tuán)隊基金項目“果菌茶加工廢棄資源的品質(zhì)分析研究”（stif-y05）。作者簡介:林斌，男，1964年出生，福建南平人，研究員，在讀博士，主要從事農(nóng)村能源與農(nóng)業(yè)環(huán)保方面的研究，通信地址：350003 福州市五四路247號福建省農(nóng)

9、科院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，tele-mail:linbin591。隨著養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的日益擴(kuò)大，大量畜禽排泄物的處理已成為一個亟待解決的問題1,高溫堆肥生產(chǎn)有機(jī)肥是禽畜糞便無害化和資源化的重要途徑2。堆肥的實質(zhì)是微生物在適宜條件下的代謝作用3，近年來，國內(nèi)外學(xué)者對在適宜條件下的豬糞發(fā)酵功能菌進(jìn)行了大量的研究，但在發(fā)酵原料上基本上都需要加入10%-25%的輔助原料如秸稈、糠殼等，用以調(diào)節(jié)豬糞等的含水率、c/n比，而后再篩選適合的發(fā)酵功能菌4-8，和大規(guī)模的禽畜糞便相比，尋找大量的堆肥發(fā)酵輔助原料無疑給企業(yè)增加了大量的成本。基于此，篩選出可以直接用于發(fā)酵處理新鮮豬糞的優(yōu)

10、良菌種，將可以大大降低豬糞堆肥處理的成本，對豬糞堆肥處理生產(chǎn)有機(jī)肥具有很好的促進(jìn)作用。本研究從發(fā)酵中的豬糞中分離出8株對豬糞堆肥發(fā)酵可能有促進(jìn)作用的菌株，采用16s rdna分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定分類及同源性分析，將不同種類的菌種直接接入新鮮的豬糞中進(jìn)行堆肥發(fā)酵，通過分析堆體的溫度、ph值、含水率、總碳（toc）、總氮(tn)、c/n比的變化情況，篩選出對豬糞堆肥發(fā)酵促進(jìn)作用的功能菌，為豬糞直接進(jìn)行堆肥發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)肥提供可用菌種。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 發(fā)酵豬糞 采自豬場常年堆肥車間中正在發(fā)酵的豬糞；新鮮豬糞：來自福建閩侯荊溪種豬場，其基本理化性質(zhì)為：含水率70.20%，ph

11、7.34,toc 22.21%,tn 0.92%,c/n比 24.11。1.1.2 儀器 sw-cj-1f超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司制造；spx-150ds-智能型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造；starter 3c ph計奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)；neofuge 15r 冷凍高速離心機(jī)，香港力康發(fā)展有限公司生產(chǎn)；mastercycler pro s 銀制梯度pcr儀，德國eppendorf公司生產(chǎn)；dyy-8c型電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)；alphalmager ep凝膠成像系統(tǒng)，cell bioscicences公司生產(chǎn)；sartorius bsa124s精密電子天平，賽多利斯科

12、學(xué)儀器有限公司；dhg-9143bs-電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，新苗醫(yī)療器械公司生產(chǎn)；kdn-102c定氮儀，上海纖維儀器有限公司生產(chǎn)。1.1.3 培養(yǎng)基na培養(yǎng)基：蛋白胨 10g，牛肉粉 2g，nacl 5g，瓊脂 15 g，水1l，ph 7.0；高氏培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20g、nacl 0.5g，kno3 1g，k2hpo43h2o 0.5g，mgso47h2o 0.5g，feso47h2o 0.01g，瓊脂 15 g，水 1l，ph 7.5。1.2方法1.2.1 菌的分離取發(fā)酵中的豬糞2g，用無菌水稀釋至10-5，取200l分別涂布于na、高氏培養(yǎng)基中，35恒溫培養(yǎng)至36h、108h，挑選出菌

13、落形態(tài)不同的單菌落，純化培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?.2.2菌的16s rdna鑒定dna的制備：將以上篩選的菌種接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，30恒溫培養(yǎng)24h，取1.5ml的菌液，采用tiangen公司的細(xì)菌基因組dna提取試劑盒提取dna。dna電泳檢測：在加入熒光染料gelview的1.0%的瓊脂糖中凝膠電泳分離，每孔點(diǎn)樣6ul(5ul樣品+1ul loading butter)，電泳為120v/h。菌16s rdna的擴(kuò)增：采用引物f968: 5-aac gcg aag ctt ac-3;l1401: 5-cgg tgt gta caa gac cc-3擴(kuò)增菌16srdna基因v6-v8可變區(qū)，擴(kuò)增

14、片段的長度約為434bp。pcr反應(yīng)體系:10*buffer(mg2+):2.5ul，dntp:2ul，f968:1ul，l1401:1ul，dna:1ul，rtaq:0.2ul，水：17.3ul。pcr擴(kuò)增程序：94預(yù)變性5min。然后94變性1min，55退火1min，72延伸1min，共35個循環(huán)，最后72充分延伸10min，4 保存。pcr產(chǎn)物檢測同dna，將含有目標(biāo)片段的產(chǎn)物送至上海生工公司單向測序。將測得的序列提交到ncbi網(wǎng)站，通過blast程序與genbank數(shù)據(jù)庫中相似性較高的菌株的16s rdna基因序列進(jìn)行同源性分析。序列的比對及系統(tǒng)發(fā)育數(shù)構(gòu)建分析采用mega4軟件進(jìn)行。

15、1.2.3 豬糞的堆肥發(fā)酵試驗 堆肥實驗于福建省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所室內(nèi)進(jìn)行，通風(fēng)狀況良好，實行人工翻堆通氣。實驗設(shè)置7個堆體，1個為對照，另外6個分別接入鑒定分類好的1-6號菌液，每個堆體高約0.9m，直徑約為1.2m，呈錐形。按0.4%的量接入菌液，所接入的菌的活菌數(shù)均大于109個g-1，對照中加入相同含量的滅菌na培養(yǎng)基。實驗分別在堆肥發(fā)酵的第0、3、7、10、13、20、27、34(d)取樣，距離堆體頂端40cm左右處分5點(diǎn)采集取樣，將樣品混勻檢測，每一處理兩次重復(fù)，對照3次重復(fù)。1.2.4 測定指標(biāo)及方法溫度采用玻棒溫度計檢測，從發(fā)酵當(dāng)天開始，每隔3天檢測1次，直至堆體接近室溫為

16、止；含水率通過測定105 24h烘干前后樣品的重量變化來確定；ph值：取鮮豬糞10g，加25ml超純水，磁力攪拌10min，放置半小時后用ph計測定；有機(jī)碳用重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法測定9；總氮用凱氏定氮法測定9；c/n比為總有機(jī)碳與總氮的比值。2結(jié)果與分析2.1 菌的分離及鑒定結(jié)果2.1.1 菌的分離及16s rdna 的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢驗從培養(yǎng)了36h的na培養(yǎng)基分離得到7株菌，計為n1-n7，從高氏培養(yǎng)基中分離到1株菌，計為g1，將8株菌進(jìn)行了dna提取，同時進(jìn)行了pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)成像，結(jié)果見圖1。電泳道（從左到右）1道為dl2000maker，從上到下的

17、片段分別為2000、1000、750、500、250、100(bp)，2道為空白對照，3-10道分別對應(yīng) n1-n7、g1號菌的16s rdna擴(kuò)增產(chǎn)物，可以看出，除了對照沒有片段外，3-10道每個擴(kuò)增產(chǎn)物片段均在250-500bp之間，確定為該菌的16s rdna pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。 圖1 菌的16s rdna擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析圖fig1.the electeophoresis analysis of amplification of strains 16s rdna by pcr2.1.2菌的鑒定根據(jù)與genebank中已有的核酸序列比較結(jié)果，除了g1菌株與數(shù)據(jù)庫中的同一種菌的同源性為97%外

18、，其余7株菌均大于99%，見表1。一般認(rèn)為，16srdna 序列同源性小于98% ，可以認(rèn)為屬于不同的種，同源性小于93-95% ，可以認(rèn)為屬于不同屬10。因此確定8株功能菌分屬于5個屬，6個種，具體為菌n1、n2、n3可確定為枯草孢桿菌（bacillus subtilis），將其記為1號菌；菌n4可確定為腸桿菌屬（enterobacter sp.）記為2號菌；菌n5可確定為地衣芽孢桿菌（bacillus licheniformis）記為3號菌；n6、g1、n7確定為包特氏菌屬（bordetella petrii）、擬諾卡氏菌屬（放線菌目）（nocardiopsis sp.）、微桿菌科（mic

19、robacterium sp.），分別記為4、5、6號菌。表1 發(fā)酵菌的鑒定結(jié)果table1 the identification results of fermenting bacteria序號菌號菌名（阿拉伯文）中文菌名max ident1n1 、n 2、 n3bacillus subtilis枯草芽孢桿菌100%2n4enterobacter sp.腸桿菌屬100%3n5bacillus licheniformis地衣芽孢桿菌100%4n6bordetella petrii包特氏菌屬100%5g1nocardiopsis sp.擬諾卡氏菌屬（放線菌目）97%6n7microbacteri

20、um sp.微桿菌99%2.1.3 菌16s rdna序列的系統(tǒng)發(fā)育分析將各菌株和應(yīng)用blast檢索到的與之有較高同源性菌株的16s rdna 序列利用mega4軟件做最大同源性比較分析，并以軟件n-j法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育數(shù)，確定菌株的分類地位。從圖2可知，n1 n2 n3基本屬于同一種的范圍，并與n5屬于同一屬范圍。其余菌各屬一屬，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。圖2 菌16s rdna的系統(tǒng)進(jìn)化樹fig2.phylogenetic tree of strains based on 16s rdna sequences homology2.2溫度堆肥中微生物分解有機(jī)物而釋放能量，

21、這些熱量使堆肥溫度上升，因此堆肥溫度能在一定程度上反映堆肥微生物活動，溫度越高，反應(yīng)速度越快，分解有機(jī)物的速度也就越快。一般認(rèn)為堆肥中溫度高于50以上的時間至少要持續(xù)5天以上，堆肥樣品才能達(dá)到無害化要求。圖3為各處理的溫度變化情況，可以看出，各處理在發(fā)酵到第三天時，溫度均達(dá)到最高值，且處理1到6號的溫度均高于60，處理3在堆肥的第3d已升至66.50.71，為各處理堆肥的最高值，此后在50以上溫度持續(xù)了7d左右，之后快速下降，到第10天已經(jīng)下降到38，接近于室溫值。處理1在堆肥發(fā)酵的第3d升至651.41，此后在50以上溫度持續(xù)了10d左右，發(fā)酵到16d時溫度還可以達(dá)到45.50.71，到19

22、天時溫度為410，發(fā)酵效果良好。處理2在堆肥發(fā)酵的第3d升至641.41，此后在50以上溫度持續(xù)了10d左右，發(fā)酵到16d時溫度還可以達(dá)到44.50.71，到19天時溫度為441.41，接近于45，是所有處理中發(fā)酵高溫持續(xù)最好的處理。處理4、5、6在堆肥發(fā)酵的第3d分別升至620、62.50.71、641.41，此后在50以上溫度都只持續(xù)了7d左右，發(fā)酵到19d時溫度分別為401.41、36.50.71、40.51.41，特別是處理5在發(fā)酵到第13天時溫度已經(jīng)降到38.50.71。對照堆肥發(fā)酵的最高溫度僅56.831.26，此后在50以上溫度持續(xù)了7d左右，發(fā)酵到19d時溫度為410.76。

23、圖3 堆肥過程中的溫度變化fig3.changes of temperature during composting2.3 含水率 圖4為各處理在堆肥過程中的含水率的變化情況，可以看出，經(jīng)過堆肥處理后，各處理的含水率均呈下降趨勢，其中處理1、2、3含水率下降最為明顯，在發(fā)酵到第34d時，分別從堆肥初始含水率70.20.6%下降到38.761.58%、40.220.76%、39.820.71%，其次處理5的含水率也下降較多，該菌在發(fā)酵20d后含水率下降較快，在發(fā)酵34d時降到了42.761.47%。而對照、處理4、處理6在發(fā)酵34d時的含水率分別為48.590.49%、51.221.44%、47

24、.11.04%，下降效果較差。圖4 堆肥過程中的含水率（%）變化fig4.changes of moisture ratio during composting2.4 ph值堆肥過程中，ph值是影響微生物生長的重要因素，一般在3-12間都可以進(jìn)行堆肥。圖5為各處理在不同發(fā)酵時間的ph值變化情況，可知看出，豬糞初始發(fā)酵ph值為7.340.13，發(fā)酵到第3d時，對照及各處理的ph值迅速下降，其中處理1、處理2下降的最多，分別降到為5.770.04、5.7950.08，對照及處理3、4、5、6也分別下降到5.890.17、6.020、5.9450.04、5.990.06，5.840.03，除了處理2

25、的最低值在發(fā)酵第7d外，其余處理的最低值均在發(fā)酵第3d。各處理經(jīng)過最低值后，又開始逐步上升，到第20d時達(dá)到發(fā)酵后的最高值，此時，對照的ph值為6.350.04，處理1-6的ph值分別為6.350.57、6.340、6.340.04、6.370.01、6.300.05、6.350.01。在堆肥最初階段，可利用的能源物質(zhì)較多，微生物繁殖很快，其活動產(chǎn)生的有機(jī)酸使堆肥的ph值下降，小分子的有機(jī)酸隨著溫度的升高而揮發(fā)，同時微生物分解含氮有機(jī)物所產(chǎn)生的氨使堆肥的ph值又開始上升。對各處理進(jìn)行分析，可以看出處理1、2在高溫期比其余處理下降的幅度大，說明這些處理在接入相應(yīng)的菌種后對有機(jī)物的分解起到一定的促

26、進(jìn)作用，使得有機(jī)酸增多，ph值下降。而后各處理ph值開始上升，到第20d，各處理的ph值達(dá)到最大，這是因為小分子有機(jī)酸的揮發(fā)及含氮有機(jī)物產(chǎn)氨的結(jié)果，而后隨著堆肥發(fā)酵時間的增加，微生物活動速度的下降，使得產(chǎn)生的氨慢慢揮發(fā)，ph值有所下降。在整個堆肥過程中，堆體的ph值在5.5-6.5之間，出現(xiàn)酸性現(xiàn)象，這可能是豬糞初始含水率過高，導(dǎo)致通氣不足，形成厭氧條件，從而造成了有機(jī)酸的大量積累。圖5 堆肥工程中ph值的變化fig5.changes of ph value during composting2.5 toc堆肥中的碳素物質(zhì)主要用于微生物活動的能源和碳源，微生物分解和轉(zhuǎn)化原料中的可降解有機(jī)物產(chǎn)生

27、二氧化碳、水和熱能。圖6為干基中的toc的含量，可以看出，各處理干基中的toc隨著堆肥時間的增加均呈下降趨勢，其中處理1、2、3在發(fā)酵到第10d時toc的含量分別為46.932.78、46.913.94%、45.741.74%，明顯低于對照50.312.78%，同時也低于處理4、5、6，結(jié)合溫度變化，可知處理1、2、3的前期發(fā)酵溫度均高于對照及其余處理，說明加入1、2、3號菌后，可以明顯加快有機(jī)物的分解速度，發(fā)酵到第34d時，對照的干基的toc含量為31.590.62，處理1至6的干基toc含量分別為30.420.33、29.370.33、26.281.00、32.240.12、29.781.

28、93、29.680.77（%），除了處理4外，其余處理的toc較對照相比有所的降低，其中處理3的下降幅度最大。圖7為鮮樣中的toc的含量變化情況，從圖中可知鮮樣中的toc的含量總體上呈下降趨勢，在發(fā)酵初期，toc的下降速度較快，到10d后，下降變緩，這主要是由于含水率下降幅度不同所導(dǎo)致，結(jié)合各處理的含水率變化情況可知，與初始含水率相比，在發(fā)酵到第10d后，各處理的含水率已經(jīng)有較大的降幅，特別是降幅較大的處理1、2，使得其鮮樣toc含量分別達(dá)到18.241.70%、17.560.03%，高于對照16.240.46%，只有處理3在含水率降幅較大情況下，鮮樣中的toc依然降到了15.810.42%。

29、圖6堆肥過程干基toc（%）含量的變化fig6.changes of toc(%) in dry matter during composting 圖7 堆肥過程中鮮樣toc（%）含量的變化fig7.changes of toc(%) in fresh matter during composting 2.6 tn堆肥中氮有機(jī)物發(fā)生降解一部分產(chǎn)生氨氣，一部分被微生物同化吸收，另一部分由固氮微生物氧化為亞硝酸鹽或硝酸鹽。圖8為各處理中不同發(fā)酵時間干基中tn的變化情況，可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，干基中的tn的含量均呈下降趨勢，其中處理1、2下降的最少，分別為1.770.12、2.080（%），

30、結(jié)合ph值的變化情況，推測可能是由于處理1、2中的ph的相對較低影響了氨氣的揮發(fā)所致，而發(fā)酵到第33d時處理3、4、5、6的tn量分別為1.210.05、1.650.08、1.350.06、1.380.08（%）均低于對照1.770.12%,這可能是在ph值變化相當(dāng)?shù)那闆r下，加入菌可以加大微生物活動強(qiáng)度，從而導(dǎo)致tn的絕對含量下降。圖9為各處理鮮樣的tn變化情況，從圖中可知，發(fā)酵到第3d時，處理1、2由于ph值低的原因使得氨氣揮發(fā)數(shù)量少，加之含水率下降等因素造成了tn相對含量高于初始含量，發(fā)酵到第10d時，由于這段時間微生物代謝旺盛，使得tn相對含量均有所下降，而后tn含量趨于平穩(wěn)，發(fā)酵到33

31、d時tn有所上升，其中處理1、2的tn分別達(dá)到1.270.03、1.130.04（%），高于初始的0.920.02%，高于對照0.910.06、同時處理3、4、5、6的tn分別為0.910.02、0.80.06、0.770.02、0.730.05，與初始tn相比，變化幅度較小。 圖8堆肥過程中干基tn（%）含量的變化fig8.changes of tn in dry matter during composting圖9堆肥過程中鮮樣tn(%)含量的變化fig9.changes of tn in fresh matter during composting2.7 c/n比c/n比是檢驗有機(jī)廢棄物

32、好養(yǎng)堆肥的一個重要指標(biāo)，碳源是微生物利用的能源物質(zhì)，氮源是微生物利用的營養(yǎng)物質(zhì)，garcia等研究認(rèn)為腐熟的堆肥的c/n應(yīng)該趨向于微生物菌體的c/n，即16左右:或者當(dāng)堆肥的c/n從開始的30降低到20以下時，就可以認(rèn)為腐熟了11。本研究中，不同處理堆肥的c/n比變化如圖10，可以看出，7個處理的c/n比均呈下降趨勢，但下降的幅度不同，在發(fā)酵到第10d時，處理1、2、3、4、6的c/n比均小于對照，其中處理1的c/n比已經(jīng)小于20，發(fā)酵到第33d時，處理1、2、3的c/n比分別降到14.640.98、15.550.49、17.370.05，均小于對照17.961.53，說明加入發(fā)酵菌有助于加快

33、堆肥腐熟進(jìn)程，特別是加入1、2、3號菌有助于豬糞堆肥c/n比的降低。圖10 堆肥過程中c/n比的變化fig10.changes of c/n during composting3 討論從正在發(fā)酵的豬糞中分離出8株菌，經(jīng)過16s rdna初步鑒定，其分屬于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、腸桿菌屬、包特氏菌屬、擬諾卡氏菌屬、微桿菌等5個屬、6個種，其中包擬諾卡氏菌屬為放線菌目，系統(tǒng)發(fā)育分析表明各屬間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在堆肥過程中，加入各菌的堆體發(fā)酵初期的最高溫度和高溫持續(xù)時間均高于對照組，說明加入各菌可加快微生物活動速度。特別是接入枯草芽孢桿菌的1處理、接入地衣芽孢桿菌的3處理和接入腸桿菌屬的處理2在發(fā)酵

34、第3天時溫度分別達(dá)到651.41、66.50.71、641.41，為各處理中的最高值，但處理3在50以上的高溫只持續(xù)了7天，而處理1、2則持續(xù)了10天。這可能是處理3中堆體的最初發(fā)酵的溫度超過65，使微生物進(jìn)入孢子形成階段，因為孢子呈不活動狀態(tài)從使堆肥的溫度迅速下降。實驗采用純豬糞進(jìn)行堆肥發(fā)酵，因此堆體初始含水率高達(dá)70.20.6%，接入各菌堆肥發(fā)酵后，處理1、2、3堆體含水率降到39%左右，同時接入擬諾卡氏菌屬的處理5也降到了42.761.47%，大大低于對照堆體的含水率48.590.49%。結(jié)合堆體溫度變化情況，不難看出含水率的下降程度與堆體達(dá)到的最高溫度及高溫持續(xù)時間基本上呈正相關(guān)。而擬

35、諾卡氏菌屬為放線菌，屬于高溫條件下的最主要菌群，在高溫條件下以孢子形式存活，因此經(jīng)過高溫堆肥后，該菌仍然繼續(xù)生長活動，因而使處理5的含水率在發(fā)酵后期繼續(xù)下降。由于初始含水率過高導(dǎo)致堆體在發(fā)酵到第3天時ph值就從初始的7.340.13迅速下降到了6左右，其中處理1、2下降的最多，除了處理2的ph最低值在發(fā)酵到第7天外，其余處理在發(fā)酵第3天時已經(jīng)達(dá)到最低值， ph值的下降主要是微生物活動產(chǎn)生的有機(jī)酸所致，因此ph值的變化在一定程度上反應(yīng)了微生物的活動情況，基于此，可推測處理1、2在發(fā)酵初期代謝旺盛，特別是處理2代謝時間持續(xù)最長，這與該堆體的高溫持續(xù)時間最長相吻合，進(jìn)一部說明該株腸桿菌對純豬糞的堆肥

36、發(fā)酵有很好的促進(jìn)作用。碳素是微生物活動的主要能源和碳源，因此有機(jī)質(zhì)的下降一定程度上反應(yīng)了微生物代謝狀況，處理1、2、3在發(fā)酵第3d時toc的絕對含量均低于對照組，在發(fā)酵到第34d時，除了加入包特氏菌屬的處理4外，其余處理的toc結(jié)對含量均低于對照，這說明處理1、2、3、5、6，特別時處理1、2、3中堆體微生物活動均較對照旺盛。后期中由于堆體的含水率下降等原因，使得部分處理的相對toc含量上升。 處理1、2堆體中tn的絕對含量和相對含量均大于對照，特別是發(fā)酵到第34d時，鮮樣中的tn大大高于初始和對照的tn含量，這主要是由于堆體含水率不斷下降，同時有機(jī)質(zhì)不斷分解，導(dǎo)致堆垛體積減少，堆體重量減輕，

37、造成tn絕對含量下降，相對含量上升。從有機(jī)肥營養(yǎng)角度考慮，加入枯草芽孢桿菌和腸桿菌屬的堆肥發(fā)酵后的豬糞有機(jī)肥可以提高總氮含量。 分析各處理的c/n比，顯示發(fā)酵到第34d時，處理1、2、3的c/n比均小于對照，說明加入1、2、3號菌有助于豬糞堆肥c/n比的降低。4 結(jié)論 （1）1號菌（枯草芽孢桿菌）和2號菌（腸桿菌屬）可提高堆體發(fā)酵溫度，增加高溫持續(xù)（50）的時間、降低腐熟后堆體水分含量，降低堆體發(fā)酵初期的ph值，增加全氮相對含量，加快c/n比的下降速度，促進(jìn)堆肥腐熟進(jìn)程。確定該兩菌株為本研究中純豬糞堆肥發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵菌株。 （2）3號菌（地衣芽孢桿菌）可提高堆體發(fā)酵溫度，降低腐熟后堆體水分含量

38、，加快c/n比的下降速度，一定程度上促進(jìn)堆肥腐熟進(jìn)程。但由于加入該菌后堆體發(fā)酵初期溫度上升過高，因此在使用該菌時應(yīng)在發(fā)酵初期增加翻堆次數(shù)，適當(dāng)降低堆體溫度，以提高其對豬糞的堆肥功效 （3）5號菌（放線菌目擬諾卡氏菌屬）在發(fā)酵后期降低了堆體的水分含量，考慮到放線菌多屬于在高溫條件下的主要菌群，因此在互不拮抗的情況下，可作為 1、2、3號菌的輔助菌種促進(jìn)純豬糞的后期二次堆肥發(fā)酵。 （4）4號菌（包特氏菌屬）和6號菌（微桿菌）雖然可以提高堆體發(fā)酵溫度，但堆體的各指標(biāo)未有明顯的優(yōu)勢，故不建議作為純豬糞發(fā)酵菌使用。參考文獻(xiàn)1 王衛(wèi)平,朱鳳香,陳曉吻,等.添加礱糠對豬糞堆肥發(fā)酵層溫度及氮素變化的影響j.浙

39、江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2009,21(6):579-582.wang wei-ping,zhu feng-xiang, chen xiao-yang,et al. effect of rice chaff with different additional amount on the changes of nitrogen and temperature in pig manure compostingj.actaagriculturae zhejian gensis,2009,21(6):579-582.2 羅泉達(dá).c/n比值對豬糞堆肥腐熟的影響j.閩西職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2008,10(1):113-

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