免疫學(xué)技術(shù)及應(yīng)用

1、免疫學(xué)技術(shù)及應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)及應(yīng)用 第一節(jié)第一節(jié) 抗原或抗體的檢測(cè)抗原或抗體的檢測(cè) n抗原和相應(yīng)抗體，無(wú)論在體內(nèi)或體外相遇，均抗原和相應(yīng)抗體，無(wú)論在體內(nèi)或體外相遇，均 可發(fā)生各種各樣的反應(yīng)，統(tǒng)稱為抗原抗體反應(yīng)?？砂l(fā)生各種各樣的反應(yīng)，統(tǒng)稱為抗原抗體反應(yīng)。 n抗原抗原-抗體反應(yīng)包括抗體反應(yīng)包括沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、溶解沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、溶解 反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和中和反應(yīng)反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和中和反應(yīng)等。等。 抗原抗原-抗抗 體反應(yīng)可體反應(yīng)可 用已知的特異性抗體檢測(cè)未知的抗原；用已知的特異性抗體檢測(cè)未知的抗原； 也可用已知的抗原檢測(cè)未知的抗體。也可用已知的抗原檢測(cè)未知的抗體。 n免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)

2、、同位素標(biāo)記技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)、 發(fā)光免疫分析等免疫標(biāo)記技術(shù)提高了抗原抗體發(fā)光免疫分析等免疫標(biāo)記技術(shù)提高了抗原抗體 反應(yīng)的敏感性。反應(yīng)的敏感性。 抗原抗體反應(yīng)的規(guī)律和特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的規(guī)律和特點(diǎn) n抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩種分子間的結(jié)抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩種分子間的結(jié) 構(gòu)互補(bǔ)性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分構(gòu)互補(bǔ)性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分 子的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定的。子的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定的。 1、 特異性 ：一種抗原只能和由它刺激產(chǎn)生的抗體相結(jié)合，不 能跟與它無(wú)關(guān)的抗體發(fā)生反應(yīng)。這種特性是由抗原的決定簇 基于抗體可變的的化學(xué)組成、空間立體構(gòu)型

3、所決定的。 2、 定比性 ：抗原一般都是多價(jià)的，而抗體（ IgG ）則是二 價(jià)的，只有二者比例適合時(shí)，抗原抗體才能結(jié)合得最充分， 形成的抗原抗體復(fù)合物最多，反應(yīng)最明顯，結(jié)果出現(xiàn)最快， 此稱為等價(jià)帶 。 3、可逆性可逆性：抗原與抗體的結(jié)合雖具有穩(wěn)定性，但由于二：抗原與抗體的結(jié)合雖具有穩(wěn)定性，但由于二 者之間是非共價(jià)鍵結(jié)合，因此又是可逆的，在一定條者之間是非共價(jià)鍵結(jié)合，因此又是可逆的，在一定條 件下可解離，且解離后各自生物活性不變。件下可解離，且解離后各自生物活性不變。 4 4、分階段反應(yīng)分階段反應(yīng) ：第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的：第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的 階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒

4、至幾分鐘，但不出現(xiàn)階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn) 可見(jiàn)反應(yīng)。第二為可見(jiàn)反應(yīng)階段，此階段反應(yīng)慢，往可見(jiàn)反應(yīng)。第二為可見(jiàn)反應(yīng)階段，此階段反應(yīng)慢，往 往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。 5 5 、敏感性敏感性 ：不僅可用于定性，還可用于檢測(cè)極微量的：不僅可用于定性，還可用于檢測(cè)極微量的 抗原抗體，其靈敏程度大大超過(guò)當(dāng)前應(yīng)用的常規(guī)化學(xué)抗原抗體，其靈敏程度大大超過(guò)當(dāng)前應(yīng)用的常規(guī)化學(xué) 方法。方法。 抗原抗體的檢測(cè)方法抗原抗體的檢測(cè)方法 n凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) n沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) n補(bǔ)體溶血反應(yīng)補(bǔ)體溶血反應(yīng) 和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng) n中和反應(yīng)中和反應(yīng) n用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原

5、抗體反應(yīng)用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) (Agglutination) n 細(xì)菌、紅細(xì)胞等細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)與相應(yīng)抗體結(jié) 合后形成凝集合后形成凝集 現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)?，F(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。 n 1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的 抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集 現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法?，F(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。 n 2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì) 胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出

6、現(xiàn)顆 粒凝集現(xiàn)象。粒凝集現(xiàn)象。 血血 球球 凝凝 集集 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) （Precipitation) 血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸 液等液等可溶性抗原可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn) 沉淀物，這一類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。沉沉淀物，這一類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。沉 淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，如絮狀沉淀。淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，如絮狀沉淀。 大多沉淀反應(yīng)是用半固體瓊脂凝膠為介大多沉淀反應(yīng)是用半固體瓊脂凝膠為介 質(zhì)，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散故也稱免疫擴(kuò)散。質(zhì)，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散故也稱免疫擴(kuò)散。 單向免疫擴(kuò)散單向免疫擴(kuò)散 (Single Immunodiffusion) n是將一定

7、量已知抗體混是將一定量已知抗體混 于瓊脂凝膠中制瓊脂板，于瓊脂凝膠中制瓊脂板， 在適當(dāng)位置打孔后將抗在適當(dāng)位置打孔后將抗 原加入孔中擴(kuò)散?？乖尤肟字袛U(kuò)散?？乖?在擴(kuò)散過(guò)程中與凝膠中在擴(kuò)散過(guò)程中與凝膠中 的抗體相遇，形成以抗的抗體相遇，形成以抗 原孔為中心的沉淀環(huán)，原孔為中心的沉淀環(huán)， 環(huán)的直徑與抗原含量成環(huán)的直徑與抗原含量成 正比相關(guān)。本法常用于正比相關(guān)。本法常用于 測(cè)定血清測(cè)定血清IgG、IgM、 IgA 和和 C 3等的含量。等的含量。 含抗體的凝膠含抗體的凝膠沉淀環(huán)沉淀環(huán) 雙向免疫擴(kuò)散雙向免疫擴(kuò)散 （Double Immunodiffusion) n位于凝膠不同小孔中的抗原和抗體，當(dāng)

8、兩者相對(duì)擴(kuò)散時(shí)，經(jīng)位于凝膠不同小孔中的抗原和抗體，當(dāng)兩者相對(duì)擴(kuò)散時(shí)，經(jīng) 一定時(shí)間后，若兩者相對(duì)應(yīng)，會(huì)在瓊脂小孔間、兩者最恰當(dāng)一定時(shí)間后，若兩者相對(duì)應(yīng)，會(huì)在瓊脂小孔間、兩者最恰當(dāng) 的比例處形成白色沉淀線。觀察沉淀線的位置、數(shù)量、形狀的比例處形成白色沉淀線。觀察沉淀線的位置、數(shù)量、形狀 以及對(duì)比各沉淀線之間的關(guān)系，可對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性分以及對(duì)比各沉淀線之間的關(guān)系，可對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性分 析。析。 n此方法可應(yīng)用于以下方面：此方法可應(yīng)用于以下方面： n（1）抗原或抗體的純度鑒定。也可對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行初步估）抗原或抗體的純度鑒定。也可對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行初步估 算。算。 n（2）用已知抗血清（或抗原）檢測(cè)

9、未知抗原（或抗體）用已知抗血清（或抗原）檢測(cè)未知抗原（或抗體） n（3）抗原或抗體相對(duì)分子量的估計(jì)）抗原或抗體相對(duì)分子量的估計(jì) n雙向瓊脂擴(kuò)散常見(jiàn)孔型有三孔型、雙孔型、雙排孔型、梅花雙向瓊脂擴(kuò)散常見(jiàn)孔型有三孔型、雙孔型、雙排孔型、梅花 孔型孔型 雙向免疫擴(kuò)散 雙向免疫瓊脂擴(kuò)散孔型 三孔型雙孔型 梅花孔型 n是將抗原與抗體分別加是將抗原與抗體分別加 入瓊脂凝膠的小孔中，入瓊脂凝膠的小孔中， 二者自由向周?chē)鷶U(kuò)散并二者自由向周?chē)鷶U(kuò)散并 相遇，在比例合適處形相遇，在比例合適處形 成沉淀線。如果反應(yīng)體成沉淀線。如果反應(yīng)體 系中含兩種以上的抗原系中含兩種以上的抗原 抗體系統(tǒng)，則小孔間可抗體系統(tǒng)，則小孔間可

10、 出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。 本法常用于抗原或抗體本法常用于抗原或抗體 的定性的定性 、組成和兩種抗、組成和兩種抗 原相關(guān)性分析的檢測(cè)。原相關(guān)性分析的檢測(cè)。 免疫電泳免疫電泳 （Immunoelectrophoresis) n免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫電泳為區(qū)帶電泳與 雙向免疫擴(kuò)散的結(jié)合。雙向免疫擴(kuò)散的結(jié)合。 先利用區(qū)帶電泳技術(shù)將先利用區(qū)帶電泳技術(shù)將 不同電荷和分子量的蛋不同電荷和分子量的蛋 白抗原在瓊脂內(nèi)分離，白抗原在瓊脂內(nèi)分離， 然后在與電泳方向平行然后在與電泳方向平行 的方向上開(kāi)槽，加入抗的方向上開(kāi)槽，加入抗 血清。血清。37下使兩者擴(kuò)下使兩者擴(kuò) 散，各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)散，

11、各區(qū)帶蛋白在相應(yīng) 的位置與抗體反應(yīng)形成的位置與抗體反應(yīng)形成 弧形沉淀線?；⌒纬恋砭€。 火箭電泳火箭電泳 （Rocket Electrophoresis) 雙向免疫電泳（two dimentional immuno-electrophoresis） n是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合 的方法。先將血清用電泳分離出各成分，的方法。先將血清用電泳分離出各成分， 然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移至另一已加有抗血清然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移至另一已加有抗血清 的凝膠上，進(jìn)入垂直方向的第二次電泳，的凝膠上，進(jìn)入垂直方向的第二次電泳， 形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。

12、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng) （Complement Fixation, CFT)Complement Fixation, CFT) 免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù) n 用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì) 標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)?？贵w反應(yīng)。 標(biāo)記物質(zhì)與抗體（或抗原）的化學(xué)連接標(biāo)記物質(zhì)與抗體（或抗原）的化學(xué)連接 未改變抗體（或抗原）的免疫學(xué)特性，未改變抗體（或抗原）的免疫學(xué)特性， 同時(shí)標(biāo)記物的性質(zhì)依然存在，因而極大同時(shí)標(biāo)記物的性質(zhì)依然存在，因而極大 的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對(duì)微量物的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對(duì)微量物 質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位

13、檢測(cè)。免疫標(biāo)質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測(cè)。免疫標(biāo) 記技術(shù)主要有三種基本類型：免疫熒光記技術(shù)主要有三種基本類型：免疫熒光 技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)。技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)。 免疫熒光顯微技術(shù)免疫熒光顯微技術(shù) (Immunofluorescence Technique) n 是用熒光素（常用的有異硫氰酸熒光素，是用熒光素（常用的有異硫氰酸熒光素， FITC) 與抗體連接成熒光抗體，再與待與抗體連接成熒光抗體，再與待 測(cè)標(biāo)本的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下測(cè)標(biāo)本的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下 觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借 此對(duì)標(biāo)本中的抗原作鑒定和定位。此

14、對(duì)標(biāo)本中的抗原作鑒定和定位。 n 包括直接熒光法、間接熒光法和補(bǔ)體包括直接熒光法、間接熒光法和補(bǔ)體 法。法。 n直接熒光法：將熒光素直接熒光法：將熒光素直接標(biāo)記抗體直接標(biāo)記抗體作標(biāo)本染作標(biāo)本染 色。該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，但其缺點(diǎn)是每檢色。該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，但其缺點(diǎn)是每檢 測(cè)一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。測(cè)一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。 n間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，再間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，再 用用熒光素標(biāo)記的二抗熒光素標(biāo)記的二抗染色。該法的優(yōu)點(diǎn)是敏感染色。該法的優(yōu)點(diǎn)是敏感 性比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗可性比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗可 用于多

15、種抗原的檢測(cè)，但非特異性熒光亦會(huì)增用于多種抗原的檢測(cè)，但非特異性熒光亦會(huì)增 加。加。 n補(bǔ)體結(jié)合免疫熒光法：此法是在間接法的第一補(bǔ)體結(jié)合免疫熒光法：此法是在間接法的第一 步抗原步抗原抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體，使之與抗原抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體，使之與抗原 抗體復(fù)合物結(jié)合；再用抗體復(fù)合物結(jié)合；再用熒光素標(biāo)記的抗熒光素標(biāo)記的抗C3 抗體抗體進(jìn)行示蹤。進(jìn)行示蹤。 間接免疫熒光法示意圖間接免疫熒光法示意圖 酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定 (Enzyme Immunoassay, EIA) n 是用酶（常用的有辣根過(guò)氧化物酶，是用酶（常用的有辣根過(guò)氧化物酶，HRP 和堿性磷酸酶，和堿性磷酸酶，AP) 標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原標(biāo)記

16、的抗體進(jìn)行的抗原 抗體反應(yīng)?？贵w反應(yīng)。EIA將抗原抗體反應(yīng)的特異性與將抗原抗體反應(yīng)的特異性與 酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過(guò)酶作用于酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過(guò)酶作用于 底物后顯色來(lái)判定結(jié)果。常用的方法有酶聯(lián)底物后顯色來(lái)判定結(jié)果。常用的方法有酶聯(lián) 免疫吸附試驗(yàn)和酶免疫組化法，前者測(cè)定免疫吸附試驗(yàn)和酶免疫組化法，前者測(cè)定可可 溶性抗原或抗體溶性抗原或抗體， 后者測(cè)定后者測(cè)定組織中或細(xì)胞組織中或細(xì)胞 表面的抗原。表面的抗原。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) n是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體是將已知的抗原或

17、抗體吸附在固相載體 （聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原 抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。用洗滌法將抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。用洗滌法將 液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾 心法、間接法心法、間接法BAS-ELISA等。等。 ELISA 放射免疫測(cè)定法放射免疫測(cè)定法 (Radioimmunoassay, RIA) n是用放射性核素標(biāo)記抗原進(jìn)行的免疫學(xué)是用放射性核素標(biāo)記抗原進(jìn)行的免疫學(xué) 檢測(cè)技術(shù)。它將放射性核素顯示的高靈檢測(cè)技術(shù)。它將放射性核素顯示的高靈 敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使 檢測(cè)的敏感性達(dá)檢

18、測(cè)的敏感性達(dá)ng水平。常用于標(biāo)記的水平。常用于標(biāo)記的 放射性核素有放射性核素有I125和和I131。常用于胰島素、。常用于胰島素、 生長(zhǎng)激素、藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。生長(zhǎng)激素、藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。 Ag* Ab Ag 標(biāo)記抗原 特異性抗體 待測(cè)抗原 ( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復(fù)合物 分離Ag*-Ab 和游離Ag* 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量 測(cè)定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性 放射免疫測(cè)定法放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖示意圖 RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線 75 50 30 10 01 10 100 1000 未標(biāo)記抗原濃度（ng/ml) 結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%） 免疫印跡法免疫印跡法 (Immunoblotting) n是將凝膠電泳與固相免疫測(cè)定結(jié)合，先是將凝膠電泳與固相免疫測(cè)定結(jié)合，先 把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體， 再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測(cè)定。該再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測(cè)定。該 法能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定法能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定 其分子量。常用于檢測(cè)多種病毒其分子量。常用于檢測(cè)多種病毒 如如HIV 的抗體或抗原。的抗體或抗原。 免疫電鏡技術(shù)（immuno-electron microscopy, IEM） n免疫電鏡技術(shù)是一種采用電子致密物質(zhì)標(biāo)記