多糖的提取和純化

1、多糖的提取和純化多糖的提取和純化多糖的提取和純化摘 要 本文較 詳細地介紹了多糖的提取和純化方法，為多糖的研究和生產(chǎn) 提供參考依據(jù)。關(guān)鍵詞 多糖；提??；純化；活性炭多糖(polysacharides, PS),又稱多聚糖，是由 10個以上的單糖 通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合 物。它廣泛分布于自然界高等植物、藻類、微生物(細菌和 真菌)與動物體內(nèi)。 20 世紀 60 年代以來,人們逐漸發(fā)現(xiàn)多 糖具有復(fù)雜的、 多方面的生物活性和功能 1：(1)多糖可作為 廣譜免疫促進劑,具有免疫調(diào)節(jié)功能,能治療風(fēng)濕病、慢性 病毒性肝炎、 癌癥等免疫系統(tǒng)疾病, 甚至能抗 AIDS 病毒 2

2、如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用 10,黑木耳多 糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強人體免疫功 能3-5 。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降 血脂、促進核酸與蛋白質(zhì)的生物合成作用。如柴胡多糖具有 抗輻射,增強免疫功能等生物學(xué)作用 6 ,麥冬多糖具有降血 糖及免疫增強作用 7-8 ,動物黏多糖具有抗凝血、降血脂等 功能 9 。(3)多糖能控制細胞分裂和分化, 調(diào)節(jié)細胞的生長與 衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用 10,銀杏外 種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥 等功能 11 。另外,多糖作為藥物,其毒性極小,因而多糖pH值、醇析濃度和植物顆粒

3、大小等。在試驗前對上述 多種因素利用正交實驗法做出優(yōu)選，才能選出最佳提取方 案。其步驟為：原料-粉碎-脫脂-粗提（2 - 3次）-吸濾或離心-沉淀-洗滌-干燥首先除去表面脂肪。原料 經(jīng)粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或 1 ： 1 的乙醇乙醚 混合液，水浴加熱攪拌或回流 1 - 3 小時，脫脂后過濾得到 的殘渣一般用水作溶劑（也有用氫氧化鉀堿性水液、氯化鈉 水液、 1醋酸和 1苯酚或 0.1-1M 氫氧化鈉作為提取溶 劑）提取多糖。溫度控制在 90- 100C,攪拌4-6小時，反 復(fù)提取 2- 3 次。得到的多糖提取液大多較粘稠，可進行吸 濾。也可用離心法將不溶性雜質(zhì)除去，將濾液或上清液混合

4、（得到的多糖若為堿性則需要中和） 。然后濃縮，再加入 2- 5 倍低級醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入費林氏溶 液或硫酸銨或溴化十六烷基三甲基銨等，與多糖物質(zhì)結(jié)合生 成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚 洗滌。將洗干后疏松的多糖迅速轉(zhuǎn)入裝有五氧化二磷和氫氧 化鈉的真空干燥器中減壓干燥（若沉淀的多糖為膠狀或具粘 著性時，可直接冷凍干燥） 。干燥后可得粉末狀的粗多糖。1.2 微波輔助提取法：其原理為利用不同極性的介質(zhì)對微波 能的不同吸收程度，使基體物質(zhì)中的某些區(qū)域和萃取體系中 的某些組分被選擇性加熱，從而使萃取物質(zhì)從基體或體系中 分離出來，進入到介電常數(shù)小，微波吸收能力較差的萃取

5、劑 中14 。由于微波能極大加速細胞壁的破裂，因而應(yīng)用于中 草藥中有效成分的提取能極大加快提取速度，增加提取產(chǎn) 率。而且由于其選擇性好，提取后基體能保持良好的性狀， 提取液也較一般的提取方法澄清 15 。聶金源等在柴胡多糖 和黃酮化合物的提取 18 中對微波輔助提取法、超聲輔助法 和索氏提取法進行比較，發(fā)現(xiàn)微波輔助提取法所需時間最短 （10min ），多糖的提取率最高（ 28.46）。1.3 超聲輔助法： 其原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出 提取，另外超聲波的次級效應(yīng)，如機械振動、乳化、擴散、 擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴散釋放并充分與 溶劑混合，利于提取 16 。超

6、聲波輔助法與常規(guī)提取法相比， 具有提取時間短、 產(chǎn)率高、 無需加熱等優(yōu)點 17 。1.4 索氏提 取法：將植物粉末置于索氏提取器中， 加入石油醚，60 C -90 C 條件下提取至無色（一般為 6 小時）。過濾，濾渣揮發(fā)干燥 完溶媒后加入 80%乙醇，再提取 6 小時，過濾，濾渣乙醇揮 發(fā)干燥后加蒸餾水?；亓魈崛?2 次，趁熱過濾，濾液減壓濃縮，再除蛋白，醇沉，除色素。60C干燥，稱重。1.5醇提法：先后將 90%和 50%乙醇加入植物粉末中，振蕩充分再抽 濾。濾液中加入足量無水乙醇，至于4C冰箱中過夜。減壓抽濾，再除去色素，得多糖粗品，在60C沙維積法（Sevag法）20:根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等

7、有機溶劑變 性而不溶與水的特點，將多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁 醇）之比調(diào)為 25:5:1 或 25:4:1 ，混合物劇烈振搖 20 到 30 分 鐘，蛋白質(zhì)與氯仿戊醇（或正丁醇）生成凝膠物而分離， 然后離心，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。此種方 法較溫和，在避免降解上有較好效果，但效率不高，如五味 子多糖的提取實驗中要重復(fù)處理達三十幾次。并且每次除去 蛋白質(zhì)變性膠狀物時，不可避免的溶有少量多糖，另外少量 多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白聚糖和糖蛋白，在處理時會沉淀下 來，造成多糖的損失。如能配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶，再用Sevage21:多糖溶 液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫下攪拌 10mi

8、n -30 %三氯醋酸，直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，在5- 10C放置過夜，離心除去沉淀即得無蛋白質(zhì)的多糖溶液。此法會 引起某些多糖的降解。Sevag通常將其與Sevag酸法 23 :取樣品濃縮液，用 2mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)其 PH 至 3， 放置過夜，在 3000r/min 條件下離心，棄去沉淀，即脫去蛋 白質(zhì)。另有李知敏 23和葉將瑜 25等人分別在植物多糖實驗 中證明：鹽酸法、三氯乙酸法及Sevag法脫蛋白率分別為72.5、46.1 和 42.3，多糖的損失率分別為 15.1%、6.1和 14.3 。鹽酸法脫蛋白率高， 但多糖的損失率也較高 ;三氯 乙酸法較溫和，但除蛋白效率不高； Sev

9、ag 5%ZnSO4 溶液和 飽和 Ba( OH)2 溶液，振蕩后離心去蛋白。此法除蛋白不 夠徹底，可結(jié)合 Sevag 法使用。還可在提取液中加入50%的TCA 溶液至沉淀完全，在 4000r/min 的條件下離心 10min ， 收集上清液，即為除蛋白液。還有人使用4:1 的氯仿 -乙醇溶液除蛋白，將混合液清搖，再靜置，取上清液。此過程需重 復(fù)多次方可除盡蛋白。除去蛋白質(zhì)的樣品用紫外分光光度計 檢驗，觀察在 280mm activated carbon)除色素12:活性炭屬于非極性吸附劑，有著較強的DEAE 纖維素或 DuoliteA DEAE 纖維素吸附，不能被水洗脫，這類色素可進行氧化脫

10、色：以濃氨水或 NaOH液調(diào)至PH8.0左右，50 C 以下滴加 H2O2 3cm pH7 進行，唯酸性多糖在 pH7 時 COOH 是以 COO離子形式存在的，需在 pH2 PH 增高或加入硼砂緩沖液使糖 的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉淀。常用的季銨鹽有 十六烷基三甲胺的溴化物（ CTAB ）及其氫氧化物（ cetyl trimethyl ammonium hydroxide ， CTA - OH ）和十六烷基吡啶 （cetylpyridinm hydroride ， CP- OH ）。 CTAB 或 CP- OH 的 濃度一般為 1- 10（ W/V ）的多糖溶液中，酸性多糖可 從中性多糖中沉淀出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各 種不同的酸性多糖。 值得注意的是酸性多糖混合物溶液的 PHDEAE 纖維素(硼酸型或堿型) ，洗脫劑可 用不同濃度的堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最 為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適于分離各種酸 性多糖、中性多糖和粘多糖。般單糖、低聚糖因醛基而發(fā)生 的顏色反應(yīng)在多糖上不明顯，電泳后常用的顯色劑是P茴香胺硫酸溶液(p anisidine)和過碘酸希夫試劑等。233凝膠柱層析 常用的凝膠是 SePhadex、SePharose、SePhacryl， 展開劑為 0.020.2molNaCl 溶液或 0