心肌細(xì)胞在高的壓下的基因表現(xiàn)心臟纖維母細(xì)胞在缺氧下的基因表現(xiàn)形式

1、臺(tái)北市立第一女子高級(jí)中學(xué)校內(nèi)科展作品說(shuō)明書簡(jiǎn)介科 別： 生物編號(hào) ：B06作品名稱：心肌細(xì)胞在高壓下的基因表現(xiàn)班 級(jí)：二年溫班指導(dǎo)老師：陳怡旴 老師 、陳錦澤 教授 作 者：蔡迪姍、吳嘉蕓一、研究動(dòng)機(jī)：高血壓所誘發(fā)的機(jī)械性展延是造成心肌肥大的基本因子。目前雖 已知機(jī)械性展延與心肌肥大之間的關(guān)聯(lián)性，但確實(shí)知分子機(jī)制則尚未 完全明朗。傳統(tǒng)上研究缺氧（Hypoxia）之基因表現(xiàn)層次大多侷限於單 一基因或少量基因，並無(wú)大量相關(guān)基因表現(xiàn)之研究。因此本實(shí)驗(yàn)主要 應(yīng)用近幾年才發(fā)展出來(lái)的微陣列基因分析技術(shù)來(lái)探討心肌細(xì)胞在展 延造成之高壓環(huán)境下其基因表現(xiàn)型式和相對(duì)量的分子關(guān)係。二、研究目的：利用活體外心肌細(xì)胞培

2、養(yǎng)系統(tǒng)，經(jīng)機(jī)械性展延的處理後，進(jìn)而抽 取和純化RNA並進(jìn)行微陣列基因分析技術(shù)，以提供高壓時(shí)心肌細(xì)胞 之基因表現(xiàn)的不同型式和相對(duì)量的重要訊息。三、實(shí)驗(yàn)器材：新生鼠數(shù)隻、CO2 In cubactor、Flexercell strain un its、Microarray四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將新生鼠的心肌細(xì)胞培養(yǎng)在可伸縮的矽膠膜培養(yǎng)皿上，利用 flexercell strain units施以20%的展延力，以模擬心肌細(xì)胞在高血壓時(shí) 的搏動(dòng)。然後抽取total RNA，並純化得mRNA，經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄作用得 到cDNA,再經(jīng)過(guò)PCR後製成cDNA probe,點(diǎn)在晶片上，與已知DNA 的片段進(jìn)行雜漬反應(yīng)。再

3、經(jīng)電腦掃描分析得到數(shù)據(jù)化的結(jié)果，了解基 因表現(xiàn)量之增減。五、實(shí)驗(yàn)方法：一、心肌細(xì)胞之細(xì)胞培養(yǎng)：包括初代心肌細(xì)胞之培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。1. 從 CQ Incubator 取出 primary cell 的培養(yǎng)皿（直徑 810cm）。2. 用 pipette抽掉舊 medium,以 35c.c的 PBS 清洗 23次。3. 加入 11.5ml Trypsin + EDTA 搖晃，使細(xì)胞 detach因?yàn)門rypsin可切斷細(xì)胞附著在plate的protein;而EDTA可拿走2+2+Ca、Mg等可促使細(xì)胞附著於plate上的物質(zhì)。4. 放入CO2 Incubator 35分鐘，以加速作用。取出後，輕拍

4、。5. 加入5c.c的新medium,搖均勻後和細(xì)胞一起吸到tube中。6. 再加入5c.c的medium反覆吸抽使細(xì)胞完全吸至tube中。7. 搖均勻後放入離心機(jī)，1200 rpm, 6 mi n, 46Z8. 取出tube,吸掉上清液9. pipetting :加 5c.c. medium到 tube 中，用 pipette反覆抽吸約 20 下10. count cell numbera. 取一滴（50卩L）等量Trypan Blue Stain 0.4混和均勻，滴在血球計(jì) 算盤上b. 蓋上蓋玻片後，在 A、B處滴上已染色的cell solution,放在顯微 鏡下數(shù)c. 可算9大格中細(xì)胞

5、，再除以9,或算其中1大格1 大格數(shù) * 104 * 2 * 10c.c. = total cell number11. 各取8c.c的medium分至5培養(yǎng)皿中再將2 c.c的細(xì)胞分至新的5 個(gè)培養(yǎng)皿，搖勻後，靜置一段時(shí)間。12. 放入 CO2 Incubator二、RNA分離，純化和鑑定：採(cǎi)用 Guanidine isothiocyana之方 法分離出total RNA,然後經(jīng)由吸光值和電泳分析以確定其濃度和純度，最後純化出mRNA。RNA 的分離1、將 plate 自 CO2 In cubactor中 拿出，以 PBS 清洗 12 次。2、加入35ml的GIT，再放至shake上搖晃數(shù)分

6、鐘。GIT的作用：a.溶掉細(xì)胞膜，使RNA跑出來(lái)。b.抑制RNase防止RNase吃掉RNA。3、用刮棒從plate上刮下，吸至tube中，力口 GIT至5ml。4、加入等量（5ml）的 phenol（酚）及 1.5ml 的 chloroform 至 tubQ5、用 shaker搖勻。6、以2000rpm 4C離心20分鐘，分離出上下兩層（上面：水層 + RNA;下面：有機(jī)層），中間有一類似薄膜物（protein）。7、將上清液吸到新的tube,但不可吸到中間的protein和下層的 有機(jī)層。8在放置上清液的tube中加入半量的冷凍（-70C）無(wú)水（99.5 %）酒精，讓RNA沉澱。9、放至-

7、70C的冰箱中凍2小時(shí)。10拿出後直接以2000rpm離心20分鐘，得上清液和質(zhì)塊沉澱物（RNA pellet）。11、去掉上清液,再離心（用真空離心機(jī)）使溶液乾掉。12、加入DEPC,溶解RNA。13用光電比色機(jī)測(cè) 0D （吸光度），OD26。/OD280越接近2,表示 所萃取的total RNA越純。14亦可去跑電泳，若跑不出來(lái)，則表示 RNA被RNase吃掉了， 而接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)也不用做了。Make Gel （ solution）H2OAgarose10*MOPS14.42 ml0.24 g2 mlFormadahyde3.58 mlTotal20 mlStep1. 調(diào)配10*MOPS和F

8、ormadahyde混和在一起（用量筒），放置一旁2. 用燒瓶，3次水和Agarose混和在一起3. 放入微波爐加熱1.52 min因不同劑量有所不同）4. 用水降溫至約5060C（以免塑膠融化）5. 加入10*MOPS和Formadahyde混和液，混和後快速到入模中6. 用針頭戳泡泡（小泡可以引到邊邊）7. 水平置於室溫約30 min, OKRNA的純化1、 用微量吸管吸取適量的total RNA （不超過(guò)1mg）移入無(wú)Rnase 的微量離心管中。2、加入DEPC處理過(guò)的水，再加入 Buffer OBB和Oligotex Suspension然後反覆抽吸使其均勻。3、將此微量離心管置入70

9、C水浴中使作用3分鐘（為了將RNA 之二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞）。4、取出後置於室溫中作用10分鐘。5、移入微量離心機(jī)中，以14000rpm離心兩分鐘，使Oligotex： mRNA複合物沉澱下來(lái)。6、再加入Buffer OW2與Oligotex： mRNA複合物混合均勻，然後 移入含Spin column（離心管柱）的微量離心管內(nèi)，以14000rpm離心一 分鐘。7、取出Spin column置於另一新的微量離心管中，加入 Buffer OW2, 14000rpm離心一分鐘，流出液不要。8再將Spin column置於另一新微量離心管內(nèi)，加入經(jīng) 70C處理 的Buffer OEB與Oligotex mR

10、NA複合物混合均勻，14000rpm分鐘。9、重複8之步驟，14000rpm離心2分鐘。10、將 8和 9之純化液混合，即可獲得 mRNA。三、mRNA的反轉(zhuǎn)錄作用mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄作用形成cDNA,其反應(yīng)mRNA, DTT, Ige pal, Primer， dNTP 和 200U Superscrip II reverse transcriptas，e 在 440C 下作 用 45 分鐘，在加入含 MgCl2，DTT，dGTP，KH2PO4 和 10U terminal deoxynucleotide transferase進(jìn)行 tailing 反應(yīng)，行成完全的單股 cDNA。四、聚合酵素

11、鏈鎖反應(yīng)單股 cDNA 再以 PCR 進(jìn)行複製,反應(yīng)總體積含 cDNA, formamide, Primer, dNTP 和 4.5U DNA polymerase。PCR的原理能使DNA在微量試管中擴(kuò)增至10八6倍以上。 首先,在要擴(kuò)增的 DNA 片段兩端分別設(shè)置一個(gè)前置引子 (forward primer)和反置引子(reverse primer)使之與已變性的單股目標(biāo) DNA作緩 冷配對(duì)(annealing)後，利用DNA聚合酵素(DNA polymerase)以目標(biāo) DNA 的兩股分別作為模板,來(lái)合成新的 DNA 股。經(jīng)由(1) 變性反應(yīng)(denaturation)使DNA的兩股分離。

12、(2) 緩冷配對(duì)反應(yīng)(annealing)使引子與目標(biāo)DNA配對(duì)。(3) 延伸反應(yīng)(extension)合成新的DNA股。興 註：反應(yīng)條件為 94 C,15sec和 65C,30sec和 68C,120sec共 30 個(gè) 循環(huán)。再進(jìn)行680C,420sec的延伸反應(yīng)。這樣循環(huán)操作每次可使 DNA 的量增加一倍,若重複操作多次,以理 想的數(shù)學(xué)式子計(jì)算,重複操作 PCR 30cycles, DNA 的分子數(shù)將會(huì)擴(kuò)增 到2八30左右。擴(kuò)充的大量DNA分子就可提供Microarray的實(shí)驗(yàn)使用。五、微陣列基因分析技術(shù)： mRNA 經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄酶作用成 cDNA probe再以附著多種基因之晶片膜進(jìn)行雜漬

13、反應(yīng)，經(jīng)由電腦軟體分析 獲得結(jié)果。1. 基因來(lái)源：(1) 藉由基因庫(kù)得到所需要的基因PCRGene Library cDNA(2) 直 接合成 oligonucleotide 直接在晶片上合成寡核甘酸，或依傳統(tǒng)的方法合成寡核甘酸後 再將基因點(diǎn)上，可檢測(cè)基因的突變和多型性。2. Microarray 的步驟：(1)從細(xì)胞中分離所需的 RNA 。(2) 將上方1之基因來(lái)源的DNA經(jīng)由arrayer註1 )機(jī)械手臂點(diǎn)在 尼龍膜 Nylon 或 Nitrocellulose membrdue 醋酸纖維膜上。(3) 將抽取的RNA弄成Probe探針)，與點(diǎn)上的基因片段進(jìn)行雜漬 反應(yīng)(Hybridizat

14、ion)(註 2 )。(4) 已呈色之cDNA array經(jīng)由Laser seanne掃描獲得影像 (image)。( 5) 影像再經(jīng)由電腦 Data proeessing 比對(duì)分析獲得結(jié)果。興 註1: arrayer唯一種機(jī)械手臂，探針頭與原子筆頭相似。經(jīng) 由電腦的控制，每一次可以在膜上點(diǎn)出一段基因。#若以1 em2 面積大小的模來(lái)作分析:在arrayer的控制下，若每一個(gè)點(diǎn)面積占0.1mm2，而它與其另一側(cè)的 點(diǎn)相隔2個(gè)0.1mm(也就是說(shuō)每個(gè)單位記成0.3mm)。則在這一個(gè)晶片 上，我們大約可以點(diǎn) 900多個(gè)樣本。註2: eDNA 標(biāo)識(shí)成探針再和 eDNA array 進(jìn)行雜漬反應(yīng):取已

15、複製過(guò)的eDNA與digoxigenin-11-dUTP (Roche)進(jìn)行標(biāo)示反應(yīng)，將以標(biāo)示好之探針經(jīng)過(guò)單股化的作用後，加入雜漬反應(yīng)液，再與CDNA assay進(jìn)行雜漬反應(yīng)作用。完成後取出已雜自之cDNA assay使用saline-sodium citrate /0.1%SDS清洗兩次，再利用 digoxigenin detection system(Roche)進(jìn)行呈色反應(yīng)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Putative Gene NameAccessi on nu mberRatio of s/cNitric oxide syn thaseH678431.70UPAR7419472.00P19 (cy

16、cli n-depe ndent kin ase in hibito2D)R7751738.00Tran scripti on factor AP-2 alphaH018181.68Ciliary n eurotrophic factor receptorR730509.00Puri ne-rich eleme nt binding prote in AH4642528.00Tran scripti onal activator SNF2aH459777.67Tran sducer of ERBB2H2985720.00Chemok ine (C-C motif) receptor2H5825

17、431.50Prefoldin 4W0450732.00Neural-cadheri n precursorT775010.20In suli n receptor precursorH039170.02PKD2R482310.04Tumor n ecrosis factor, alpha-i nduced protein 6R735320.03Excisi on repair cross-compleme nting rode nt repair deficie ncy, compleme ntati on group 5H185270.08Tumor n ecrosis factor (l

18、iga nd) superfamily, member 10H445680.04mutL homolog 1H308570.06Glutaredox inR921980.04七、討論：何以得知基因表現(xiàn)的差異是因?yàn)槿毖醯臓顟B(tài)所造成，而不是因?yàn)?細(xì)胞的個(gè)體差異或其他影響因素？首先當(dāng)然要盡量 減少不必要的變因，所以同一次實(shí)驗(yàn)是由同一隻 老鼠身上取得心臟纖維母細(xì)胞。其次，欲確定基因表現(xiàn)真的為缺氧所 造成，可看兩個(gè)方面：時(shí)間效應(yīng)與劑量效應(yīng)一一a. 時(shí)間效應(yīng)：可對(duì)處?kù)锻瑯尤毖鯒l件下的細(xì)胞，進(jìn)行缺氧時(shí)間長(zhǎng) 短的控制，如我們的實(shí)驗(yàn)中，便有1小時(shí)、3小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、 48小時(shí)不等的缺氧時(shí)間。b. 劑量

19、效應(yīng)：要造成缺氧條件所用的儀器一多灌入 N2的In cubactor可藉由調(diào)整灌入N2的量，造成不同的缺氧程度，如：正常 應(yīng)有20%的02,在N2的In cubactor中,可能只有3%、5%、10%,即可對(duì)細(xì)胞造成不同的缺氧狀態(tài)。而上述兩方面，皆有其 正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，即時(shí)間或劑量的增加或 減少，會(huì)造成基因表現(xiàn)隨之增加或減少。故若實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有時(shí)間 效應(yīng)或劑量效應(yīng)，則可確定基因表現(xiàn)量之改變確為缺氧狀態(tài)所造成。八、結(jié)論:分析出心肌細(xì)胞在缺氧時(shí)，其基因表現(xiàn)量的增減。九、參考資料及其他:1 . Reactive oxygen species modulate endothelin-l-induced c-fos gene expression incardiomyocytes . T.H. Che ng , N. L.Shih , S.YChe n , L.Wa ng , J.J.Che n2 . The transcriptional program in the r