第七章--植物花藥和花粉培養(yǎng)PPT課件

1、1 2 植物單倍體培養(yǎng)方法: 花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng) 胚珠或子房培養(yǎng)（未受精） 3 植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史 Guha和Maheshwari （1964） 曼陀羅花藥培養(yǎng) Nitsch 和 Norreel (1973) 煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)） Chu （1973）小麥花粉培養(yǎng) （早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自 發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低） 80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子 培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。 90年代，一些先前被認為是不易進行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù) 成功Konzak (1999) 。 4 概念： 花

2、藥和花粉培養(yǎng)：指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑， 使其不形成配子，而像體細胞一樣進行分裂、分化、最終發(fā) 育成完整植株。該發(fā)育途徑被稱為“花粉孢子體發(fā)育途徑” 或“雄核發(fā)育”。 兩者的異同點 培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。 花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細胞培養(yǎng)。 花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可 觀察雄核發(fā)育的全過程；單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復雜。 5 花藥或花粉培養(yǎng)的作用： 供體植株 小孢子（n） 花培 花粉植 株（n） 雄核發(fā)育 自然加倍 人工加倍 純合植株DH （2n） 一年內(nèi)獲得純系 1、作物育種 （1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小 孢子培養(yǎng)

3、僅需一年。 6 例子： 二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基 因為AAbb的純合單株 常規(guī)方法： AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb 與Aabb、aAbb區(qū)分開。 ABaBAbab ABAABBAaBBAABbAaBb aBaABBaaBBaABbaaBb AbAabBAabBAAbbAabb abaAbBaabBaAbbaabb 7 例子： 二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基 因為AAbb的純合單株 單倍體方法： AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。 單倍體單倍體 二倍體二倍體 AB- - AABB aB- aaBB Ab- AAbb ab- - aabb

4、 供體親本 AaBb 花培 8 植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當代及 時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。 9 2、物種進化研究 可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植 物減數(shù)分裂時，形成二價體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是 否存在同源染色體。 3、遺傳分析 單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個基 因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可 用于基因的劑量效應(yīng)分析。 4、構(gòu)建連鎖圖譜 雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效 地用于遺傳圖譜的構(gòu)建 5、用于遺傳轉(zhuǎn)化 能直接表達外源基因，不受顯隱性影響 10 花粉孢子體發(fā)育途徑 （雄核發(fā)育） 11 一、花粉發(fā)育的階段

5、 花粉離體培養(yǎng)時， 雄核發(fā)育最適宜 的時期一般是第 一次有分裂或之 前。 12 二、雄核發(fā)育途徑 1、A途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成營養(yǎng)細胞和 生殖細胞 （1）A-V途徑 由營養(yǎng)細胞重復分裂形成單倍體 （2）A-G途徑 由生殖細胞重復分裂形成單倍體 （3）A-VG途徑（E途徑） 由營養(yǎng)細胞和生殖細胞各自獨立分裂， 共同形成單倍體 （4）C途徑 營養(yǎng)細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株 2、B途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的 兩個細胞。然后由這兩細胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合 形成多倍體植株 13 14 1、雄核發(fā)育與P花粉的形成 P-花粉：具胚胎發(fā)

6、生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花 粉）或不染色花粉（NS-花粉） 2、雄核發(fā)育與饑餓處理 饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動雄核 發(fā)育。 三、雄核發(fā)育啟動機理 15 1、胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段， 最后子葉展開，形成花粉植株。 2、愈傷組織發(fā)育途徑 小孢子分裂數(shù)次形成愈傷， 再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變 異且倍性復雜。 四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式 16 胚狀體發(fā)育途徑 部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株 煙草花藥培養(yǎng) 17 通過胚狀體途徑再生形成小植株 煙草花藥培養(yǎng) 18 胚狀體發(fā)育途徑 a) 球形胚 d) 魚雷形胚 蕓苔屬小孢子培養(yǎng) 19 愈傷組織發(fā)育途

7、徑 部分花藥產(chǎn)生愈傷組織 接種在平板上的水稻花藥 水稻花藥培養(yǎng) 20 愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株 水稻花藥培養(yǎng) 21 花藥和花粉培養(yǎng)方法 22 一、花藥培養(yǎng) 1、取材 鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。 2、消毒 70酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡30-60s后在1 次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1的氯化汞溶液中消毒3-10min， 無菌水沖洗3-5次。 3、培養(yǎng) 固體或液體培養(yǎng)基均可。先進行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大 量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）； 后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。 23 二、花粉培養(yǎng) (一)花粉

8、的分離與純化 1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法) 將花藥接種在預處理液或液 體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。 2、擠壓法 在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。 3、機械游離 （1）磁攪拌法 用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來； （2）超速旋切法 通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使 小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。 4、小孢子純化 對上述方法獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心 處理純化小孢子 24 梯度離心前 （小孢子形態(tài)、活力不一致） 30%蔗糖梯度離心后 （獲得均一的小孢子群體） 25 (二)花粉培養(yǎng)方式 1、平板培養(yǎng) 花粉置瓊脂固

9、化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 2、液體培養(yǎng) 花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。 3、雙層培養(yǎng) 花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法： 先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。 4、看護培養(yǎng) 利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進花粉 小孢子發(fā)育。 5、微室培養(yǎng) 利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養(yǎng) 6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng) 利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取 物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。花藥條件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。 26 看護培養(yǎng)圖解 27 三、白化苗現(xiàn)象 28 （一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機理 1、內(nèi)因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育

10、時 期。 2、外因 預處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、 愈傷組織轉(zhuǎn)分化時間等。 3、機理 核基因起關(guān)鍵作用，導致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生白苗。另 外地、無性系變異也可能是原因之一。 （二）白化苗的控制 通過對花粉發(fā)育時期、預處理、培養(yǎng)基成分等因素進行調(diào)控。 29 四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素 （一）基因型 植物基因型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種 中的不同基因型對小孢子離體誘導反應(yīng)差異較大。 如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠低于糯稻。 30 蕓苔屬植物Brassica napusBrassica napus不同基因型的小 孢子產(chǎn)胚率比較 Topas 10,000-

11、200,000 1-20 Westar 1000-10,000 0.1-1 Delta 100-10,000 0.01-1 Bounty 10-100 0.001-0.01 基因型胚狀體數(shù)量/106小孢子 成苗率（%） 31 （二）供體植株生長條件和生理狀態(tài) 1、植株生長條件 光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般 處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。 2、植株生長時期 一般是開花始期優(yōu)于開花末期。 3、P花粉的頻率 不同溫度、日照時數(shù)、氮饑餓及生長物質(zhì)處 理提高P花粉的數(shù)量 32 （三）花粉發(fā)育時期 小孢子發(fā)育時期對誘導雄 核發(fā)育非常重要。 33 四分體四分體: 醋酸洋紅染色醋酸

12、洋紅染色 四分體四分體: Alexanders 染色染色 單核期單核期 雙核期雙核期 成熟花粉粒成熟花粉粒 處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子 34 單核晚期單核晚期 液泡液泡 第一次有絲分裂后期第一次有絲分裂后期 雙核早期雙核早期 雙核中期雙核中期 生殖核生殖核 生殖核生殖核 營養(yǎng)核營養(yǎng)核 35 一般而言，單核期（第一次有絲 分裂前）對誘導反應(yīng)最敏感，為 最佳培養(yǎng)期。 形成雙核后，在合適的條件，主 要由營養(yǎng)細胞分裂產(chǎn)生胚狀體。 36 不同物種誘導胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期 發(fā)育時期物種 減數(shù)分裂期草莓、番茄 四分孢子期葡萄 單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯 單核晚期荔枝、茄子、青椒、

13、小麥 單核早期至晚期煙草 單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍 四分孢子期至雙核 期 玉米 37 對不同發(fā)育階段的花藥進行對不同發(fā)育階段的花藥進行 培養(yǎng)測試培養(yǎng)測試 確定最佳小孢子發(fā)育時期的確定最佳小孢子發(fā)育時期的 形態(tài)特征形態(tài)特征 注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)注意形態(tài)特征會因品種、發(fā) 育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而 發(fā)生變化發(fā)生變化 處于不同發(fā)育階段的煙草花芽處于不同發(fā)育階段的煙草花芽 花粉發(fā)育時期的確定 38 （四）預處理 預處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件 預處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從 配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小 孢子）。

14、適當?shù)念A處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。 預處理方法：主要是對花藥進行適度的逆境處理，包括低溫、高 溫、化學物質(zhì)、離心、射線等。 39 1、高低溫處理 低溫預處理：指在接種之前將材料用0以上低溫處理一段 時間后再接種。應(yīng)用較多。處理溫度一般在1-14，時間從幾小時 至幾十天不等。不同作物所用的預處理溫度及時間差異較大。不同 的處理溫度需要不同的時間。 例子:小麥穗子培養(yǎng)前4預處理幾天，花藥培養(yǎng)效率顯著提高。 十字花科未經(jīng)低溫預處理的花蕾，每花藥產(chǎn)胚數(shù)為4.39個，6- 9處理1天，產(chǎn)胚數(shù)提高到61.4個，預處理4天后，胚狀體產(chǎn)量降為 10.47個。 預處理方法： 40 高溫處理（熱擊處理）：指花藥接

15、種后，先在較高 溫度下（30-35）培養(yǎng)數(shù)天，然后再移至正常溫度下 繼續(xù)培養(yǎng)。 例子:如煙草，32高溫；小麥，33高溫預處理 顯著地提高了小孢子胚胎發(fā)生能力（Touraev，1996） 41 2、化學物質(zhì)處理 包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進行處理。 甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理 是造成小孢子營養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化。 3、其它 包括射線、離心、磁場等。 42 （五）培養(yǎng)基 1.基本培養(yǎng)基 主要為N6和MS培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出一些其 它的培養(yǎng)基。如H培養(yǎng)基（適于煙草）、C17培養(yǎng)基 （適于小麥）、馬鈴署-培養(yǎng)基（適于馬鈴署） 43 2.碳源 包括蔗糖、麥芽糖、纖

16、維二糖、葡萄糖、果糖、 海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所 差異。一般認為單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度 要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖 似乎為最好的碳源。 44 3、激素 4、氨基酸 5、活性碳 6、pH 45 （六）培養(yǎng)條件 1、溫度 物種間有差異 2、光照 3、植板密度 植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。5103到2104ml 密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對低密度的小 孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細胞分裂的空間，從則 有利于胚狀體發(fā)生。 46 （七）花藥壁因素 花藥組織的存在對小孢子的胚性分裂具有明顯的促進作用。 但花藥壁損傷會釋放有

17、毒物質(zhì)影響小雄核的發(fā)育。 47 單倍體植株鑒定和染色體加倍 48 一、倍性鑒定 （為什么要進行倍性鑒定？） 1、染色體直接計數(shù)法 通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進行制片，直接計數(shù)染色體 數(shù)目。 2、間接鑒定 （1）掃描細胞光度儀鑒定（流式細胞儀） 主要測定葉片單個細胞 中DNA的含量確定細胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。 （2）細胞形態(tài)學鑒定法 葉片保衛(wèi)細胞大小、單位面積上的氣孔 數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。 （3）植株形態(tài)學鑒定法 單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭 長，花粉粒小，不結(jié)實。 49 （4）雜交鑒定法自交或測交鑒定，看后代分離情況確定 二倍體植株是

18、來自小孢子還是體細胞。 （5）分子標記鑒定包括生化標記（如同工酶標記）和分子 標記（如RFLP、RAPD、AFLP等） 50 二、染色體加倍 （為什么要進行加倍？） （一）莖段培養(yǎng)將單倍體植株的莖段進行培養(yǎng)，誘導愈傷 組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率的 核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細胞，分化出純合的二倍體植 株。 51 二、染色體加倍 （為什么要進行加倍？） （二）化學試劑誘變有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。 1、秋水仙素誘導 （1）浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再 轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 （2）生長錐處理 秋水仙素水溶液直接涂抹生長點（頂芽或腋芽）。 （3）培養(yǎng)基處理 將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附 加一定濃度和秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙 素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。 2、除草劑誘導 （毒性小，引起植株的變異幾率小） 52 花藥和花粉培養(yǎng)基本流程： 預處理花藥（物理或生理逆境） 收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子 培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體 胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)”形