酶聯(lián)免疫ELISA使用試劑盒檢測過程中值得關(guān)注的問題

1、酶聯(lián)免疫（ELISA ）使用試劑盒檢測過程中值得關(guān)注的問題1、儀器質(zhì)控為使儀器保持最佳工作狀態(tài)，應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP ），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍）、溫箱、洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。移液器：ELISA加樣量小（20-200g l，其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法檢查：低、中、高三 個(gè)刻度分別吸取指示量的水，萬分之一天平稱重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在%以內(nèi)；恒溫箱：經(jīng)常檢查恒溫箱溫度計(jì)所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實(shí)測溫度是否一致，允許有的誤差;洗板機(jī)： 每個(gè)廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定，一般不超過2g|人工扣板時(shí)，墊紙不濕；定期檢查管孔是否堵塞；酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其

2、光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。2、試劑盒選擇應(yīng)盡量選擇正規(guī)廠家，產(chǎn)品經(jīng)相應(yīng)政府部門審核認(rèn)可，試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡 便性、安全性及經(jīng)濟(jì)性全面評(píng)價(jià)。靈敏度：有二層含義，1 ）為試劑檢出被檢物質(zhì)的最低量的能力；2）為試劑對大量樣品中陽性檢出的能力。特異性：常用交叉反應(yīng)率表示。 含有與待測物相近結(jié)構(gòu)部份的物質(zhì)可能存在交叉反應(yīng)，使測定結(jié)果升高,可能導(dǎo)致假陽性，所以交叉反應(yīng)是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi) CV%，其值應(yīng)小于15% ;定量試劑應(yīng)同時(shí)考察線性范圍。準(zhǔn)確度：通過添加回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。簡便性：指在不影響試劑的前三項(xiàng)

3、指標(biāo)的前題下，實(shí)驗(yàn)和測定步驟越少越好，在定性實(shí)驗(yàn)中結(jié)果判斷簡 單明了，定量試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算也應(yīng)簡單。安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。 經(jīng)濟(jì)性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生產(chǎn)或技術(shù)進(jìn)步降低成本，而市場價(jià)格比較合理。 試劑評(píng)價(jià)：需要有權(quán)威的確證方法和確證的樣品進(jìn)行檢測。3、樣本前處理注意事項(xiàng)3.1 均質(zhì)組織樣本 :肉、肝食品類切細(xì)，用絞肉機(jī)反復(fù)絞碎，混合均勻。水產(chǎn)樣本： 去除樣品的非食用部分， 食用部分切細(xì)， 用均質(zhì)器均漿； 原料表面較臟時(shí) ,需適當(dāng)用蒸餾水清洗。 蛋類：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。水果、蔬菜類：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。3.2 振蕩提取 將提

4、取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使提取溶劑與容器內(nèi)的樣品充分接觸以深入到樣本組織 內(nèi)部，提取待測組分。3.2.1 振蕩方式：振蕩器上進(jìn)行上下、往返式振蕩、手搖式上下振蕩。3.2.2 在組織樣本中加入有機(jī)溶劑之間提取時(shí)，應(yīng)邊加邊振蕩，防止組織凝結(jié)成團(tuán)，不利于提取。33在用有機(jī)溶劑提取過程中，如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，解決的方法有：用細(xì)頭輕輕的攪拌，破壞乳化后，再重復(fù)離心。再加入適量的提取劑，重新振蕩。注意離心后要保證樣本的稀釋倍數(shù)不變。3.4 濃縮 由于凈化過程中引入的溶劑，可能會(huì)降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機(jī)溶劑。即試劑盒前處理步驟中把樣本在 60 C氮?dú)庀麓蹈桑儆脧?fù)

5、溶液溶解干燥殘留物。濃縮方式：氮?dú)獯蹈沙s、壓縮空氣吹干除雜。注意：3.4.1 在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質(zhì)干擾。3.4.2 在吹樣本時(shí)，針頭應(yīng)在液面上空，避免與樣本接觸，防止產(chǎn)生交叉污染。3.4.3 樣本吹干后應(yīng)立即取下，避免吹的時(shí)間過長，影響最終檢測結(jié)果。3.4.4 不同的藥物，吹干后樣本的保質(zhì)期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復(fù)溶。3.5 凈化經(jīng)過提取的待測組分中通常含有一些會(huì)干擾試劑盒中抗原抗體反應(yīng)的雜質(zhì)或者是含有與待測物結(jié)構(gòu)相似 的雜質(zhì)。將待測組分與雜質(zhì)分離的過程，我們稱為試劑盒中樣本的凈化。在我們現(xiàn)有的試劑盒前處理方法 中涉及到的最常見的凈化是：液液分配法。比如：用復(fù)溶液

6、溶解干燥殘留物之前先加入適量的正己烷，在加入正己烷和復(fù)溶液渦動(dòng)后如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可以60 C水浴加熱，至乳化現(xiàn)象消失或減弱后，加大離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心。實(shí)例：A、氟喹諾酮類藥物試劑盒現(xiàn)有的水產(chǎn)樣本前處理方法中，用二氯甲烷作為提取劑。注意：(a) 二氯甲烷的密度比水大，離心完后，二氯甲烷在下層，須先用加樣器吸盡上層廢液后，再按要求取適量 的下層吹干。(b) 在用加樣器吸取下層的有機(jī)相時(shí)， 正常操作往往取量不準(zhǔn)確， 此時(shí)最好用帶有刻度， 且刻度較準(zhǔn)確的玻 璃管來定量。(c) 上訴情況對有經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)員還可以通過靈活控制加樣器來控制取樣的準(zhǔn)確性。(d) 在振蕩過程中要注意安全。二氯甲烷在振蕩的過程中，如

7、果離心管密封性不是很好，往往容易爆開；在 進(jìn)行振蕩時(shí)，不要讓離心管口對準(zhǔn)自己或者其他人，避免濺到自己或者他人身上。(e) 試劑盒在使用前充分回溫很必要，如回溫不充分該項(xiàng)目曲線受影響較明顯。B、硝基呋喃代謝物檢測過程中常見問題硝基呋喃代謝物有四種：3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM) 和1-氨基-2-內(nèi)酰脲(AHD)在檢測過程中也需要同其它項(xiàng)目一樣進(jìn)行添加回收測評(píng)，其中需要注意以下幾個(gè) 問題。代謝物在組織中是與蛋白呈結(jié)合狀態(tài)，采用普通的有機(jī)溶劑或緩沖液，是無法提取該代謝物的。需要用鹽酸水解后才能使呋喃類代謝物游離，所以在加入去離子水

8、、鹽酸和2-硝基苯甲醛(2-NBA)混合均勻后，其 pH 應(yīng)在 1-3 之間，否則不利用水解代謝物。在衍生化過程中，溫度和時(shí)間決定其衍生化產(chǎn)率，衍生化后在加入氫氧化鈉和磷酸氫二鉀時(shí)，其pH 應(yīng)在中性左右。由于部分樣本的緩沖能力不同，所以需對其 pH 進(jìn)行測定，因?yàn)樵谒嵝曰驂A性環(huán)境中，不利于 呋喃類代謝物的提取回收，同時(shí)也容易出現(xiàn)假陽性。添加回收的幾種誤區(qū)： 呋喃類代謝物提取過程通常分三個(gè)關(guān)鍵步驟：水解衍生化 提取( 1 )采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行添加回收。如德國拜發(fā)和我公司AOZ 試劑盒中的第 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)4.05ppb，AMOZ試劑盒中的第6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)8.1ppb。因?yàn)檫@些標(biāo)準(zhǔn)品是已經(jīng)過

9、衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)品，不能代 表樣本前處理實(shí)驗(yàn)中的加酸水解和加衍生化試劑衍生這兩個(gè)步驟，所以就算回收率很高，但失去了實(shí)際參 考價(jià)值。(2)完全依賴未衍生的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收。因部分未衍生的代謝物在配制成標(biāo)準(zhǔn)品后有一定的 有效期，會(huì)存在潛在的不穩(wěn)定因素，而且添加回收僅能考證衍生化和提取兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，不能驗(yàn)證從組織蛋 白中水解呋喃類代謝物的過程，因此也有一定的局限性。最好的評(píng)價(jià)方案：采用經(jīng) LC-MS-MS 確證的陰陽性樣品，留作質(zhì)控樣品，對檢測的樣本和試劑盒進(jìn)行質(zhì) 量評(píng)價(jià)。這也是實(shí)驗(yàn)室所出數(shù)據(jù)可信度最具說服力的關(guān)鍵點(diǎn)。4、酶標(biāo)分析過程中的注意事項(xiàng)樣本的檢測是基于抗原抗體的反應(yīng)， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，

10、判定樣本最終的藥物含量。 它要求加樣的準(zhǔn)確性和 洗板的一致性。在整個(gè)加樣的過程中注意實(shí)驗(yàn)室溫度的恒定，保證反應(yīng)在試劑盒所示的溫度下進(jìn)行。4.1 常見加樣方式A、吸一打二B 、吸二打一在實(shí)際操作過程中，提倡用 “吸二打一 ”用這種方式，有如下幾個(gè)好處：a 、加樣過程中在板孔內(nèi)不出現(xiàn)或者很少出現(xiàn)氣泡b 、提高加樣速度，縮短前后樣本反應(yīng)的時(shí)間差。在加樣的過程中還應(yīng)細(xì)心注意避免出現(xiàn)下列現(xiàn)象：A、加樣的過程中漏加或者重加；B、加樣的過程中忘記更換吸頭；C、樣本的重加或者漏加；D、忘記記錄樣本的加樣順序。4.2 常見的洗板方式A、洗板機(jī)洗板；B 、多道孔加樣器洗板；C、多孔吸頭洗板；在洗板的過程中，確保每孔所加洗滌液量的均一，按說明書操作，不可過多，避免溢出板孔，污染其它 樣本；過少，則達(dá)不到洗滌的效果，容易出現(xiàn)曲線不成線性，花板等情況。4.3 甩板 快速甩盡板孔內(nèi)的液體，防止板孔里的液體對流或反濺回板孔中產(chǎn)生交叉污染。4.4 拍板 輕輕的在吸水紙上扣干板孔內(nèi)的液體，而且吸水紙只能使用一次。4.5 顯色 值得注意的是，并非試劑盒中所規(guī)定的顯色時(shí)間是絕對的，因?yàn)樵噭┖械奈舛戎禃?huì)受環(huán)境中的溫度