免疫共沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)操作步驟

1、免疫共沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)操作步驟免疫共沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)操作步驟一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的

2、。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。二、準(zhǔn)備工作：預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋

3、冰下），離心機(jī)1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS；2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1ml/107個(gè)細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶，0.5ml/5106個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶)3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4，緩慢晃動(dòng)15min（EP管插冰上，置水平搖床上）4. 4，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中5. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠6. 每1ml總蛋白

4、中加入100l Protein A瓊脂糖珠（50%），4搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景7. 4，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定蛋白濃度，測(cè)前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20保存一個(gè)月）9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 g/l，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 g/l）10. 加入一定體積的兔抗到500l總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白

5、在不同細(xì)胞系中的多少而異11. 4緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育12. 加入100l Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 l過(guò)渡抗體（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800l/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS14. 用60l 2上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上

6、樣多少的需要而定（60 l足夠上三道）15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。RIPA Buffer配制：基礎(chǔ)成分：Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性）NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集）NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲(chǔ)存液）去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲(chǔ)存液；避光保存）注意：準(zhǔn)備激酶（致活酶）實(shí)驗(yàn)時(shí)，不要加去氧膽酸鈉，因?yàn)殡x子型去污劑能夠使酶變性，導(dǎo)致活性喪失。RIPA蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲(chǔ)存液，室溫保存）EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲(chǔ)存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20保存）抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20保存）胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20保存）RIPA磷酸