新型黑麥酮酸d衍生物d69抗乳腺癌活性研究的論文

1、新型黑麥酮酸d衍生物d69抗乳腺癌活性研究的論文新型黑麥酮酸d衍生物d69抗乳腺癌活性研究的論文作者：袁潔,何振健,朱勛,吳玨珩【摘要】 目的研究一種來(lái)源于海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的新型黑麥酮酸d衍生物d69對(duì)人乳腺癌的體內(nèi)外抑制活性，并初步探討其分子機(jī)理。 方法 通過(guò)鏡下觀察以及mtt比色法檢測(cè)d69的細(xì)胞毒作用，構(gòu)建人乳腺癌裸鼠移植瘤模型研究d69體內(nèi)抗腫瘤活性。 結(jié)果 d69對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435和zr-75-30的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性增強(qiáng)。其對(duì)mda-mb-435和zr-75-30細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(ic50)分別為0.031 mol/l和0.036 mol

2、/l，而對(duì)人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec的抑制作用較低，ic50為0.686 mol/l。人乳腺癌裸鼠移植瘤模型驗(yàn)證d69能顯著抑制在體腫瘤的生長(zhǎng)。 結(jié)論 d69可能是一種潛在的乳腺癌化療藥物的先導(dǎo)化合物。 【關(guān)鍵詞】 海洋微生物;黑麥酮酸d衍生物;抗腫瘤;人乳腺癌;人乳腺癌裸鼠移植瘤模型abstract:objectiveto investigate the in vitro and in vivo anti-breast cancer activity of d69,a novel member of secalonic acid family,which was derived from

3、marine commensal microorganisms.methods the inhibitory effects of d69 on growth of breast cancer cell lines and the human mammary epithelial cell line were determined by mtt assay.in addition,the in vivo antineoplastic effect of d69 on balb/c-nude mice bearing human breast cancer cell line mda-mb-43

4、5 was investigated.results the ic50 values of d69 on mda-mb-435 and zr-75-30 cell lines after 48 h treatment were 0.031 mol/l and 0.036 mol/l,respectively.in contrast,inhibition of the growth of the immortalized breast epithelial cells,hmec by d69,with an ic50 of 0.686 mol/l,was far milder than that

5、 of the inhibition on human breast cancer cells.treatment with d69 markedly suppressed the growth of sarcoma xenograft in syngeneic balb/c-nude mice in a time-dependent manner,and the reduction in tumor growth rate was significant in xenografts treated with 200 g/kg d69.conclusion these data suggest

6、ed that d69 might be used as a promising chemotherapeutical agent for treatment of breast cancer and other solid cancers.key words:marine microorganismssecalonic acid d analogantitumorhuman breast cancernude mice bearing human cancer cell據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)(american cancer society)的統(tǒng)計(jì)，2007年全世界新增癌癥病例約1 200萬(wàn)，死于癌癥

7、的人數(shù)約760萬(wàn)，也就是說(shuō),平均每天約有2萬(wàn)人死于癌癥1。www.11665.com其中乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在北美、澳大利亞、北歐和西歐等西方發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率非常高2。傳統(tǒng)的天然抗癌藥物一般來(lái)源于陸上植物以及陸棲微生物的提取，但是隨著幾十年長(zhǎng)時(shí)間的開(kāi)發(fā)，陸上被開(kāi)發(fā)出的新活性物質(zhì)的概率越來(lái)越小，難度也越來(lái)越大。于是，人們希望從海洋生物中分離得到新的活性物質(zhì)3。自20世紀(jì)50年代始，隨著光譜學(xué)、高通量篩選以及結(jié)構(gòu)分析技術(shù)等的發(fā)展，已從海洋生物中分離篩選到如ecteinascidin-743、aplidine、bryostatin 1、黑麥酮酸d素等多種具有結(jié)構(gòu)多樣且效果較好的抗腫瘤活

8、性物質(zhì) 4-8。d69是從海洋源性的一株鏈霉菌菌株的次生代謝產(chǎn)物中分離得到的一種化合物，含有環(huán)狀的五肽內(nèi)酯環(huán)和發(fā)色基團(tuán)，屬于新型的黑麥酮酸d衍生物。通過(guò)對(duì)其體內(nèi)外具有潛在的抗腫瘤活性的研究，從細(xì)胞和分子水平上初步探討d69對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435和zr-75-30、人永生化乳腺上皮細(xì)胞系hmec(human mammary epithelial cell)均為本實(shí)驗(yàn)室保存，并已在本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的其他研究項(xiàng)目中使用9。1.1.2化合物d69由中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程

9、學(xué)院林永成教授提供。其結(jié)構(gòu)運(yùn)用核磁共振(h-nmr、13c-nmr、 hsqc、hmbc)、高分辨質(zhì)譜 (esi-ms )等進(jìn)行初步鑒定10。各種化合物由二甲基亞砜(dmso)(sigma公司)制備保存母液。1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雌性balb/c裸鼠，體質(zhì)量1820 g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：scxk(粵)2008-0020，粵監(jiān)證字：2008a004。在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部以spf條件飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：syxk(粵)2007-0081。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435和zr-75-30培養(yǎng)于含5%()胎牛血清、2 mmol/

10、l l-谷氨酰胺、0.1 mmol/l非必需氨基酸、10 mmol/l hepes、100 iu/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的dmem完全培養(yǎng)基中，置于37 、5%()co2孵箱中孵育培養(yǎng);傳代時(shí)先用1 pbs清洗細(xì)胞，再用含0.02%edta的0.05 %胰酶消化，以dmem完全培養(yǎng)基終止消化。人乳腺上皮細(xì)胞hmec培養(yǎng)于無(wú)血清ksfm培養(yǎng)基中，置于37 、5%co2孵箱中孵育培養(yǎng);傳代時(shí)用上述胰酶消化，以胰酶抑制劑終止消化。以上細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均為invitrogen/gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)自hyclone公司。1.2.2四甲基偶氮唑藍(lán)(mtt)法檢測(cè)細(xì)胞增殖將mda-mb

11、-435、zr-75-30和hmec細(xì)胞消化后重懸并計(jì)數(shù)，按每孔1.0104個(gè)細(xì)胞分別接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 、5%co2孵箱中孵育培養(yǎng)。24 h后去除培養(yǎng)基，更換為含濃度依次為0、0001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4 mol/l d69的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)的變化。隨后每孔加入5 mg/ml mtt (genview公司，用1磷酸鹽緩沖液溶解，終質(zhì)量濃度5 mg/ml，過(guò)濾除菌，分裝后-20 避光保存)溶液20 l，37 作用4 h，離心后棄上清液，加入dmso 150 l,振蕩器振蕩10 min

12、充分溶解結(jié)晶，置酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm下的吸光度a值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組平均a值-實(shí)驗(yàn)組平均a值)/對(duì)照組平均a值100 %。對(duì)照組即d69濃度為0的培養(yǎng)孔。使用半數(shù)抑制濃度(ic50)計(jì)算軟件blisss software計(jì)算ic50，應(yīng)用spss軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。1.2.3d69抑制人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435生長(zhǎng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)每只balb/c裸鼠右側(cè)乳腺接種數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435細(xì)胞5106(100 l)。接種腫瘤后第6天，將14只裸鼠隨機(jī)等分為2組。待瘤直徑在3050 mm后，以30 g/kg劑量的d69，每2天腹腔注射給藥1次，持續(xù)30

13、d，觀察并記錄d69的體內(nèi)抑瘤作用。腫瘤體積計(jì)算公式：體積(mm3)=長(zhǎng)徑短徑2/6。根據(jù)各組皮下移植瘤體積，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積的均數(shù)值并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。d69注射29 d后，處死，迅速取下腫瘤標(biāo)本，稱重。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)100%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例(中華人民共和國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)令第2號(hào)，1988)。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)結(jié)果以(s)表示，組間比較采用單因素方差分析，p<0.05為差異具有顯著性。2結(jié)果2.1d69對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435、zr-75-30生長(zhǎng)和形態(tài)的影響在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察d69處理后細(xì)胞生長(zhǎng)情

14、況及形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)d69對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-435、zr-75-30的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用(見(jiàn)圖1、2)。隨著d69濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞死亡現(xiàn)象越來(lái)越明顯，出現(xiàn)大面積的脫落，細(xì)胞及細(xì)胞碎片漂浮液面。這種細(xì)胞形態(tài)的改變與細(xì)胞凋亡所發(fā)生的形態(tài)改變十分的相似11。psa6681;s*2圖1人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435經(jīng)不同濃度d69處理后的形態(tài)變化(200,48 h)figure 1morphological changes of human breast cancer cells mda-mb-435 treated with indicated concentrat

15、ions of d69(200,48 h)2.2d69對(duì)人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec生長(zhǎng)和形態(tài)的影響為檢測(cè)d69對(duì)非腫瘤細(xì)胞的毒性，以人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec為模型，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察d69處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，d69對(duì)hmec細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用較人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435和zr-75-30要小得多(見(jiàn)圖3)。 2.3d69對(duì)mda-mb-435、zr-75-30和hmec細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)mda-mb-435、zr-75-30和hmec細(xì)胞分別以不同濃度的d69處理48 h，mtt結(jié)果顯示，d69以劑量依賴型的方式抑制人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-43

16、5和zr-75-30的增殖。其中對(duì)mda-mb-435細(xì)胞的抑制率最高，其作用48 h后的ic50為0.031 mol/l。其次是zr-75-30細(xì)胞，ic50為0.036 mol/l，而d69對(duì)于人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec的抑制率最低，ic50為0.686 mol/l，見(jiàn)圖4。psa6682;s*3圖2人乳腺癌細(xì)胞zr-75-30經(jīng)不同濃度d69處理后的形態(tài)變化(200,48 h)figure 2morphological changes of human breast cancer cells zr-75-30 treated with indicated concentrations

17、of d69 (200,48 h)psa6683;s*2圖3人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec經(jīng)d69處理后的形態(tài)變化(200，48 h)figure 3morphological changes of hmec treated with indicated concentrations of d69 (200,48 h)2.4裸鼠異體移植瘤模型中d69的體內(nèi)抗腫瘤作用體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，給藥組能顯著地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其腫瘤抑制率為81.11%，差異具有顯著性，對(duì)腫瘤的抑制效果更為明顯。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，小鼠的體質(zhì)量并沒(méi)有明顯的改變。見(jiàn)圖5、表1。psa6684;s*2圖4d69對(duì)mda-m

18、b-435、zr-75-30和hmec細(xì)胞生長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)曲線3討論能夠產(chǎn)生黑麥酮酸系列化合物的真菌廣泛分布于各種陸地和海洋12-14。到目前為止，已經(jīng)有6種(a、b、c、d、e、f、g)不同的黑麥酮酸被發(fā)現(xiàn)。研究表明，黑麥酮酸d比其他5個(gè)同系物具有更強(qiáng)的藥理活性，同時(shí)具有更小的毒性 15。本文所涉及的活性化合物d69是從南海海洋微生物的次生代謝產(chǎn)物中篩選得到的，具有黑麥酮酸基本骨架的一種結(jié)構(gòu)新穎的黑麥酮酸d衍生物。本文研究了黑麥酮酸d衍生物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。mtt體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，d69對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435和zr-75-30的增殖具有明顯的抑制作用，ic50分別為0

19、.031 mol/l和0.035 mol/l;而對(duì)于人永生化乳腺上皮細(xì)胞hmec的抑制率最低，這說(shuō)明對(duì)于乳腺癌細(xì)胞來(lái)講，d69對(duì)于腫瘤細(xì)胞的選擇性毒性較強(qiáng)，而對(duì)于非腫瘤的永生化乳腺細(xì)胞毒性較弱。為了進(jìn)一步確認(rèn)d69的抗腫瘤活性以及其對(duì)正常細(xì)胞、組織的低毒副作用，本文建立了穩(wěn)定的人mda-mb-435乳腺癌移植瘤裸鼠模型，結(jié)果表明，d69對(duì)于裸鼠體內(nèi)乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)亦具有顯著抑制作用，且小鼠的體質(zhì)量沒(méi)有明顯的改變。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示d69是一個(gè)非常有希望的具有抗腫瘤活性的小分子化合物，但其抗腫瘤的分子機(jī)制及細(xì)胞內(nèi)分子靶點(diǎn)還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 garcia m,jem

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