高效液相色譜檢測(cè)微生物細(xì)胞醌類(lèi)組分的技術(shù)規(guī)程

1、高效液相色譜(hplc)檢測(cè)微生物細(xì)胞醌類(lèi)組分的技術(shù)規(guī)程起草單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目 次前 言31.范圍42.術(shù)語(yǔ)與定義42.1.菌體真空冷凍干燥（freeze-drying）42.2.高效液相色譜（hplc）42.3.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)42.4保留時(shí)間ret.time(rt)43.方法和條件43.1.試劑43.2.主要儀器與器材44.醌樣品的制備44.1 收集菌體44.2 破壁44.3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)44.4純化55.高效液相色譜(hplc)測(cè)定醌類(lèi)組分55.1.準(zhǔn)備工作55.2 色譜條件55.3結(jié)果分析5參考文獻(xiàn)6前 言醌是微生物化學(xué)分類(lèi)指征之一，它是原核生物原生質(zhì)膜上的組份，在電子傳遞和氧化磷酸化中

2、起重要作用。醌主要有兩種類(lèi)型:甲基萘醌和泛醌。在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和放線(xiàn)菌中主要合成甲基萘醌。醌類(lèi)組分中異戊二烯側(cè)鏈的長(zhǎng)度和氫的飽和度有重要的分類(lèi)學(xué)意義。每種細(xì)菌都有一個(gè)主要的醌類(lèi)組分，一個(gè)微生物群體中醌類(lèi)種類(lèi)和數(shù)量的不同反映了群體組成的多樣性，醌類(lèi)譜已經(jīng)作為細(xì)菌群體組成多樣性的一個(gè)指標(biāo)，在環(huán)境微生物中廣泛使用。高效液相色譜測(cè)定醌類(lèi)更快速，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，是一種醌類(lèi)組分測(cè)定的理想方法。制定本規(guī)程的目的在于提供了一種原核生物中醌類(lèi)提取與hplc檢測(cè)的有效技術(shù)。本規(guī)程由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心起草承擔(dān)。高效液相色譜(hplc)檢測(cè)微生物細(xì)胞醌類(lèi)組分的技術(shù)規(guī)程1. 范圍本規(guī)程規(guī)定了高效液相色譜

3、(hplc)檢測(cè)微生物細(xì)胞醌類(lèi)組分的技術(shù)規(guī)程，本規(guī)程主要適用于細(xì)菌等原核生物醌類(lèi)組分的檢測(cè)。2. 術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本規(guī)程2.1. 菌體真空冷凍干燥（freeze-drying）指將欲干燥的菌種細(xì)胞或孢子，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華。2.2. 高效液相色譜（hplc）高效液相色譜用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入待測(cè)樣品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。2.3. 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)在減壓條件下連續(xù)蒸餾大量易揮發(fā)性溶劑，尤其對(duì)萃取液的濃縮和色譜分離時(shí)的接收，可以分

4、離和純化反應(yīng)產(chǎn)物。2.4 保留時(shí)間ret.time(rt)是指被測(cè)組分從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所需的時(shí)間，等于組分在流動(dòng)相中停留的時(shí)間加在固定相中所停留的時(shí)間。3. 方法和條件3.1. 試劑醌提取試劑：氯仿；甲醇；丙酮；苯；gf254硅膠板(青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng)，100200 mm)；試劑均為分析純。hplc檢測(cè)試劑：甲醇（色譜純）；異丙醇（色譜純）；超純水3.2. 主要儀器與器材高效液相色譜儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀4. 醌樣品的制備4.1 收集菌體菌體搖瓶培養(yǎng)，通過(guò)離心收集菌體，蒸餾水洗滌兩次，離心后真空冷凍干燥，如果暫時(shí)不進(jìn)行制備，菌粉可以于4 c保存?zhèn)溆谩?.2 破壁取凍干菌體約100 mg

5、，加入氯仿 : 甲醇(2 : 1；v/v)的溶液40 ml，在黑暗處磁力攪拌10 h左右。4.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)在黑暗處用濾紙過(guò)濾收集濾液，用減壓旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀40減壓蒸餾至干燥。用少量(1 ml) 丙酮重新溶解干燥物，長(zhǎng)條狀點(diǎn)樣于gf254硅膠板上(青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng)，100200 mm)，硅膠板最好在65活化半個(gè)小時(shí)左右。同時(shí)在一端點(diǎn)vk做對(duì)照。4.4 純化 以苯作展層劑，展層約20 min。取出風(fēng)干后在254 nm紫外燈下觀察。rf=0.8，在綠色螢光背景下呈暗褐色的帶即為甲基萘醌的位置，與vk位點(diǎn)齊平，若rf=0.4-0.5的位置有暗褐色的帶則為泛醌組分。(注意不能在紫外燈下長(zhǎng)時(shí)間照射，以免

6、醌降解)。 刮下顯色的條帶，用1ml丙酮溶解，然后用細(xì)菌濾器過(guò)濾除去硅膠，收集濾液(可適當(dāng)濃縮至200 l300 l),即得醌類(lèi)組分的丙酮溶液。置于4, 黑暗處保存。5. 高效液相色譜(hplc)測(cè)定醌類(lèi)組分5.1. 準(zhǔn)備工作 5.1.1 溶劑的準(zhǔn)備正確準(zhǔn)備溶劑對(duì)于高效液相色譜(hplc)試驗(yàn)是非常重要的，它能有效地避免鬼峰、降低基線(xiàn)噪聲，從而提高分析能力。hplc試驗(yàn)均應(yīng)使用高純度的溶劑，hplc級(jí)純度的溶劑比分析級(jí)(ar)溶劑的純度更高，選擇色譜級(jí)的甲醇與異丙醇作為流動(dòng)相。要保證配制流動(dòng)相用水的純度足夠高，用超純水或從商店購(gòu)買(mǎi)的純凈水。5.1.2 過(guò)濾理想情況下，所有溶劑都要通過(guò)045 m

7、 濾膜過(guò)濾后再使用，這樣能夠有效防止由于微粒存在導(dǎo)致流路管線(xiàn)堵塞、過(guò)濾后應(yīng)把溶劑放在密封容器中，以防止被重新污染。過(guò)濾后的溶劑既可用于色譜分析，也可用于清洗諸如泵頭、柱塞樸、單向和密封圈等儀器部件，最大程度地清洗好這些部件能保證系統(tǒng)性能良好。5.1.3 脫氣在流動(dòng)相進(jìn)入hplc系統(tǒng)之前應(yīng)首先脫氣。沒(méi)有脫氣的流動(dòng)相進(jìn)入到高壓系統(tǒng)產(chǎn)生的氣泡會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)不穩(wěn)、出現(xiàn)鬼峰等問(wèn)題。從溶液中排除氣泡的方法主要有：氦氣脫氣、超聲波脫氣和真空脫氣。氦氣或其他低溶解度氣體足脫氣的有效方法；在線(xiàn)連續(xù)脫氣可以防止空氣重新溶解在溶劑中。5.2 色譜條件分析柱：c18 (ods 5 m ,2504.6 mm id)；流動(dòng)相

8、：甲醇 : 異丙醇 (2 : 1；v/v)；流速：1.00 ml/min；柱溫：40 c；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm和270 nm進(jìn)樣量：10l5.3 結(jié)果分析在上述色譜條件下對(duì)已制備好的醌的丙酮溶液進(jìn)行檢測(cè)，將待測(cè)定的醌類(lèi)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜對(duì)照，從而確定微生物中各個(gè)醌類(lèi)組分。以菌株2622 的醌型圖譜分析如下：no. ret.timepeak nameheightarearel.areaamounttypeminmaumau*min%111.51mk-6136.12030.27523.89n.a.bmb*214.70mk-7282.87872.81057.45n.a.bmb*319.62q-107

9、5.68023.64118.66n.a.bmb*total:494.679126.727100.000.000經(jīng)由高效氣相色譜分析，菌株2622細(xì)胞中提取醌類(lèi)組分有三種，保留時(shí)間ret.time(rt)為11.5 min左右，與mk-6的保留時(shí)間一致。保留時(shí)間為14.7 min左右，為mk-7,保留時(shí)間為19.62 min，為q-10。其中，菌株2622醌類(lèi)組分以mk-7為主，占總醌的57.45%，另外兩種比較多的醌類(lèi)組分q-10占18.66%，mk-6占23.89%。參考文獻(xiàn)1 東秀珠蔡妙生。常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)，2001，第二版，科學(xué)出版社，350419。2 郭春雷彭謙。高溫菌研究進(jìn)展。生物學(xué)雜志，2003，20(4)，13。3 陶天申楊瑞馥東秀珠。原核生物系統(tǒng)學(xué)。2007，第一版，化學(xué)工業(yè)出版社，127128。4 collins, m. d., pirouz, t., goodfellow, m. & minnikin, d. e. (1977).distribution of menaquinones in actino