實驗四、原生質(zhì)體的分離效率、體積和表面積測定

1、實驗四、實驗四、 原生質(zhì)體的分離效率、體積和原生質(zhì)體的分離效率、體積和 表面積的測定表面積的測定 1、掌握原生質(zhì)的分離和提純技術(shù)； 2、原生質(zhì)體積和表面積的測定； 3、分離效率的測定（目視法和熒光雙醋酸酯法） 實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模?實驗原理實驗原理 原生質(zhì)體的研究是近年來在生物學中比較活躍的領(lǐng)域之一。原生質(zhì)體的研究是近年來在生物學中比較活躍的領(lǐng)域之一。 原生質(zhì)體（原生質(zhì)體（ProtoplastProtoplast）一詞的使用始自一詞的使用始自Hanstein(1880), 是指：是指： “用質(zhì)壁分離能夠和細胞壁分開的那部分物質(zhì)組成了一個原生質(zhì)體用質(zhì)壁分離能夠和細胞壁分開的那部分物質(zhì)組成了一個原

2、生質(zhì)體” 或或“除去了全部細胞壁的細胞除去了全部細胞壁的細胞”， “一個為質(zhì)膜所包圍的裸露細胞一個為質(zhì)膜所包圍的裸露細胞”。 原生質(zhì)體的分離和提純是植物生理學、細胞生物學中的一項基本技術(shù)。原生質(zhì)體的分離和提純是植物生理學、細胞生物學中的一項基本技術(shù)。 利用制備的原生質(zhì)體可進行離體培養(yǎng)、全能性表達、細胞壁再生、質(zhì)利用制備的原生質(zhì)體可進行離體培養(yǎng)、全能性表達、細胞壁再生、質(zhì) 膜特性，以及各種細胞操作（如原生體融合）、遺傳操作（如外源基膜特性，以及各種細胞操作（如原生體融合）、遺傳操作（如外源基 因的導入）等，廣泛應(yīng)用于抗性生理、病性生理和細胞融合等領(lǐng)域。因的導入）等，廣泛應(yīng)用于抗性生理、病性生理和

3、細胞融合等領(lǐng)域。 早期分離制備原生質(zhì)體采用早期分離制備原生質(zhì)體采用機械法機械法。其。其缺點缺點是：是： （1）手續(xù)繁多，得率少；）手續(xù)繁多，得率少； （2）材料局限于具有較大液泡的細胞或長形細胞的組）材料局限于具有較大液泡的細胞或長形細胞的組 織，如葉片、球莖的鱗片，果實表皮等?？?，如葉片、球莖的鱗片，果實表皮等。 直到直到1960年，年，Cocking 試用試用酶解法酶解法制備番茄原生質(zhì)制備番茄原生質(zhì) 體首次獲得成功。體首次獲得成功。 其原理是細胞壁的組成物質(zhì)主要有纖維素、半纖維素其原理是細胞壁的組成物質(zhì)主要有纖維素、半纖維素 和果膠等，利用和果膠等，利用纖維素酶和果膠酶纖維素酶和果膠酶等在

4、一定的條件下等在一定的條件下 可將細胞壁的組成物質(zhì)分解掉，使得原生質(zhì)體游離出可將細胞壁的組成物質(zhì)分解掉，使得原生質(zhì)體游離出 來。來。 圖1、利用酶解法獲得的蠶豆葉片細胞原生質(zhì)體 A Root400 B Leaf400 圖圖2 大豆幼苗根和葉片原生質(zhì)體的分離和純化大豆幼苗根和葉片原生質(zhì)體的分離和純化 實驗材料實驗材料 未經(jīng)抗寒未經(jīng)抗寒 鍛煉的小鍛煉的小 麥幼苗麥幼苗 抗寒鍛煉抗寒鍛煉 的小麥幼的小麥幼 苗。苗。 儀器與藥品儀器與藥品 光學顯微鏡、培養(yǎng)箱、血球計數(shù)板、計 數(shù)器、物鏡和目鏡測微尺、小搖床、離 心機、酸度計。 纖維素酶、果膠酶、山梨醇、KCl、 CaCl2、山梨醇、金鋼砂。 實驗步驟實

5、驗步驟 （1 1）酶液配制：）酶液配制： 根據(jù)酶液用量，用冰冷的含 5mmol/L KCl、5mmol/L CaCl2、0.6mol/L山梨醇等 滲溶液配制含1.5% 纖維素 酶、0.5%果膠酶的溶液 （用于分離未經(jīng)鍛煉的植 物組織，經(jīng)鍛煉的植物組 織用0.9mol/L 山梨醇等滲 溶液配制），攪拌溶解， 用1N HCl調(diào)pH至5.5, 1500g離心10分鐘，上清液 （酶液）冷貯備用。 等滲溶液（適用于等滲溶液（適用于 鍛煉和非鍛煉材料鍛煉和非鍛煉材料 2種）種） 酶液（適用于鍛煉和酶液（適用于鍛煉和 非鍛煉材料非鍛煉材料2種）種） 原生體的分離：原生體的分離： （1）取小麥葉片（挑大者），

6、去除尖端和基部后（中段） 稱取0.5克； （2）置于培養(yǎng)皿中加入少量金鋼砂，用毛刷刷去表皮角質(zhì) 層，經(jīng)自來水沖洗后用濾紙吸干，葉面呈均勻水漬狀 即可； （3）用鋒利剪刀或刀片將其制成2mm長的小段，放入 100ml燒杯中加入10 ml酶液； （4）置于33-35C的培養(yǎng)箱內(nèi)的小搖床上（約30-40rpm） 培養(yǎng)3h, 或靜置培養(yǎng)5h左右； （5）混合物經(jīng)雙層紗布過濾，以去除組織的殘余物，用 500rpm離心3-5min, 小心果斷棄去上清液； （6）小心懸浮沉淀物，加相應(yīng)等滲溶液5ml稀釋； （7）再離心一次，去上清液，小心懸浮，用等滲溶液定容 至一定體積(0.2-0.5 ml, 具體視原生質(zhì)

7、體數(shù)量而定）。 計數(shù)和測定分離效率：計數(shù)和測定分離效率： 熟悉血球計數(shù)板的使用和計數(shù)方法，按下列要求進行 計數(shù)： （a) 洗凈、涼干計數(shù)板； (b) 上板均勻； (c) 以綠、亮、圓形的原生質(zhì)體為有活力的； (d) 同區(qū)域計數(shù)要設(shè)重復(fù)（10個左右）。 因而可計算出每克鮮重葉片所分離出的原生質(zhì)體數(shù) (單位：個/g FW)。 血球計數(shù)板的總體積為： 0.30.3（長）（長） 0.30.3（寬）（寬） 0.010.01（厚）（厚）=0.0009(cm=0.0009(cm3 3) ) 原生質(zhì)體表面積（原生質(zhì)體表面積（SA）和體積（）和體積（V）的）的 測定測定 目鏡和物鏡測微尺的校正（?m/格目鏡）；

8、 離體原生質(zhì)體在等滲溶液中呈圓球形; 計數(shù)要設(shè)重復(fù)（10個左右） 懸浮于等滲溶液中的原生質(zhì)體的表面積和體積，可通 過在高倍光學顯微鏡下用目鏡和物鏡測微尺測量其直 徑(D)而求得。為了便于在冰凍過程中對植物細胞的脫植物細胞的脫 水情況和原生體失去滲透反應(yīng)能力水情況和原生體失去滲透反應(yīng)能力進行定量的研究。 SA=4（D/2）2 V=4(D/2)3/3 圖3 物鏡測微尺示意 圖4 目鏡測微尺示意 圖5 目、物鏡測微尺校準示意（舉例） 提純：提純： 可采用離心洗滌法和漂浮法兩種方法。 離心洗滌法就是重復(fù)（二）中離心、棄上清、懸浮沉淀、加 等滲液再離心、再棄上清和懸浮沉淀的過程，鏡檢直至滿意 為止。其優(yōu)點是省事，但缺點是比原生質(zhì)體重的雜質(zhì)（如金 鋼砂）去不掉。 漂浮法：加4ml左右17%蔗糖溶液（用于未經(jīng)鍛煉的植物材料， 鍛煉材料用23%的蔗糖溶液）于離心管中，再用彎頭吸管緩 慢加入等體積的 0.6mol/L山梨醇溶液（用于未經(jīng)鍛煉的植物 材料，鍛煉材料用0.9mol/L山梨醇溶液）,使兩溶液間建立界 面層，用彎頭吸管把1/3總