電泳的應(yīng)用-YC

1、電泳的應(yīng)用 生化第三組 制 一、電泳的發(fā)展歷程 上世紀(jì)60-70年代 1937 1809 俄國(guó)物理學(xué)家Pece首先發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象 瑞典的Tiselius建立了分離蛋白質(zhì)的界面電泳 電泳技術(shù)才開(kāi)始應(yīng)用 濾紙、聚丙烯酰胺凝膠等介質(zhì)相繼引入電泳 電泳技術(shù)迅速發(fā)展 豐富多彩的電泳形式使其應(yīng)用十分廣泛 上世紀(jì)80年代 新發(fā)展起來(lái)的毛細(xì)管電泳技術(shù)， 是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的 重要新發(fā)展 醫(yī)藥 電泳噴漆與五金表面處理 小分子物質(zhì)的分離、分析 工業(yè) 二、電泳的分類(lèi) 泳泳 漆漆 電泳 (工業(yè)) 電電 鍍鍍 20世紀(jì)60年代由福特汽車(chē)公司最先應(yīng)用于汽車(chē)底漆。 由于其出色的防腐、防銹功能，很快在軍工行業(yè)得到 廣泛

2、應(yīng)用 近幾年才投入運(yùn)用的，利用電解原理在某些金屬表面上鍍 上一薄層其它金屬或合金的過(guò)程，是利用電解作用使金屬 或其它材料制件的表面附著一層金屬膜的工藝 二、電泳的分類(lèi) 電泳 (醫(yī)藥) n自由電泳自由電泳 n區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳 濾紙電泳濾紙電泳（常壓及高壓） 粉末電泳粉末電泳（纖維素粉，淀粉，玻璃粉電泳） 薄層電泳薄層電泳（薄膜及薄板） 凝膠電泳凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯 酰胺凝膠） 緣線電泳緣線電泳（如尼龍絲，人造絲電泳） 等速電泳等速電泳 等電聚焦等電聚焦 電泳電泳 需使用專(zhuān)用電泳儀，電泳平衡后，各電泳區(qū) 帶相隨，分成清晰界面，以等速向前運(yùn)動(dòng)。 兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中自動(dòng)形成pH梯度，

3、當(dāng)被 分離的生物大分子移動(dòng)到各自等電點(diǎn)的pH處 聚集成很窄的區(qū)帶。 n穩(wěn)態(tài)電泳穩(wěn)態(tài)電泳 自由電泳與顯微技術(shù)的組合，利用不同細(xì) 胞或同種細(xì)胞不同狀態(tài)的PI不同進(jìn)行分離。 細(xì)胞電泳細(xì)胞電泳 自由流動(dòng)幕電泳自由流動(dòng)幕電泳一種制備用的連續(xù)電泳 移界電泳移界電泳 在層析柱中進(jìn)行的電泳 柱電泳柱電泳 二、電泳的分類(lèi) 電泳 (醫(yī)藥) n免疫電泳免疫電泳 n毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 n雙向凝膠電雙向凝膠電 泳泳 第一向采用等電聚焦電泳 將復(fù)雜的PI不同的蛋 白質(zhì)進(jìn)行分離。 第二向采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 按蛋白質(zhì)分子量的大小在垂直方向進(jìn)行分離 對(duì)流免疫電泳對(duì)流免疫電泳 火箭免疫電泳火箭免疫電泳

4、放射免疫對(duì)流電泳放射免疫對(duì)流電泳 免疫固定電泳免疫固定電泳 酶標(biāo)對(duì)流免疫電泳酶標(biāo)對(duì)流免疫電泳 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE) 毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳(CGE) 毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC) 毛細(xì)管等電聚焦電泳毛細(xì)管等電聚焦電泳(CIEF) 毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管等速電泳(CTTP) 毛細(xì)管電色譜非毛細(xì)管電色譜非(CEC) 水介質(zhì)毛細(xì)管電泳（水介質(zhì)毛細(xì)管電泳（NACE） 三、電泳的應(yīng)用 1.涂層豐滿(mǎn)、均勻、平整、光 滑 2.硬度、附著力、耐腐、沖擊 性能、滲透性能明顯優(yōu)于其它 涂裝工藝 3.采用水溶性涂料，節(jié)省了大 量有機(jī)溶劑，大大降低了環(huán)境 危害，避免了火災(zāi)的

5、隱患 泳漆 廣泛應(yīng)用于汽車(chē)、 火車(chē)、飛機(jī)外殼; 冰箱、洗衣機(jī)、空 調(diào)等家電金屬外殼 著漆 三、電泳的應(yīng)用 電鍍 防止腐蝕，提高耐磨性、提高 導(dǎo)電性、提高反光性及增進(jìn)美 觀 廣泛應(yīng)用于金屬灶臺(tái)、 洗碗池、水龍頭鎖具， 硬幣，首飾，汽車(chē)耐磨 部分等的表面處理 細(xì)胞電泳 移界電泳 1937年瑞典Uppsala 大學(xué)的Tiselius 用蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法， 并首次證明了血清是由白蛋白及、 球蛋白組成的，并獲得了 1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 應(yīng)用應(yīng)用：初步分離血清蛋白 等速電泳 采用兩種不同濃度的電解質(zhì)組成，一種為前導(dǎo)電解質(zhì)，充滿(mǎn)整個(gè)毛細(xì)管柱；另一 種為尾隨電解質(zhì)，置于一端的電泳槽中。前導(dǎo)電解質(zhì)

6、的遷移率高于任何樣品組分， 后者則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強(qiáng)電場(chǎng) 的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)分 離。 等速電泳示意圖 應(yīng)用：應(yīng)用：初步分離樣品組初步分離樣品組 分分 等電聚焦電泳 等電聚焦電泳是從凝膠電泳發(fā)展而來(lái)的，在凝膠中通過(guò)加入兩性電解質(zhì)形成 一個(gè)pH 梯度，兩性物質(zhì)在電泳過(guò)程中會(huì)被集中在與其PI相等的pH區(qū)域內(nèi)， 從而得到分離。 使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度，梯度， 由于由于“聚焦效應(yīng)聚焦效應(yīng)”，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的

7、區(qū)帶界面；，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面； 電泳速度快電泳速度快; 分辨率高分辨率高; 加入樣品的位置可任意選擇；加入樣品的位置可任意選擇； 等電聚焦可以用于測(cè)定某個(gè)未知蛋白質(zhì)的等 電點(diǎn) 等電聚焦具有很高的靈敏度，特別適合于研 究蛋白質(zhì)微觀不均一性 同工酶之間可能只有一兩個(gè)氨基酸的差別， 利用等電聚焦也可以較好的分離同工酶。 等電聚焦主要用于分離分析，但也可以用于 純化制備生物大分子。如抗體，藥品等。雖 然成本較高，但操作簡(jiǎn)單、純化效率很高。 例如：一種蛋白質(zhì)在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)單一帶，而 在等電聚焦中表現(xiàn)三條帶。這可能是由于蛋白質(zhì)存在單磷酸化、雙磷 酸化和三磷酸化形

8、式。 紙帶電泳 1948年Wieland 和Fischer 發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳 方法，對(duì)氨基酸進(jìn)行分離。 設(shè)備操作簡(jiǎn)單，分辨率差，電滲現(xiàn)象設(shè)備操作簡(jiǎn)單，分辨率差，電滲現(xiàn)象 。 應(yīng)用應(yīng)用：在血清樣品的臨床檢測(cè)和病毒 分析等方面有重要用途 醋酸纖維薄膜電泳 對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無(wú)“拖尾”現(xiàn)象。 快速省時(shí)。親水性小，吸水少，電滲作用小。 靈敏度高，樣品用量少。臨床醫(yī)學(xué)用于檢測(cè)微量異常蛋白的改變。 應(yīng)用面廣?？捎糜谀切┘堧娪静灰追蛛x的樣品，如胎兒甲種球蛋白、溶 菌酶、胰島素等。 醋酸纖維薄膜電泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干 板，有利于光密度計(jì)和分光光度計(jì)掃描定量及長(zhǎng)期保

9、存。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：分辨率差 應(yīng)用：應(yīng)用： 廣泛用于分析檢測(cè)血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎兒甲種球蛋白、 體液、脊髓液、脫氫酶、多肽、核酸及其他生物大分子，為心血管 疾病、肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據(jù)， 為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)。 同功酶的分離 用在免疫電泳中 正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖 1：清蛋白；2：1-球蛋白；3：2-球蛋白；4：-球蛋白；5：-球蛋白；6 ：點(diǎn)樣原點(diǎn) 瓊脂糖凝膠 瓊脂糖凝膠屬于大孔膠，可以分析10-7的大分子，但電泳分辨率 低于聚丙烯酰胺凝膠電泳。這種大孔特性有利于免疫固定、免 疫電泳和微量制備。 具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，對(duì)樣品吸附極小，電泳圖譜清晰，

10、 分辨率高，重復(fù)性好 應(yīng)用：應(yīng)用： DNA分子的鑒定（大小，構(gòu)象）與分型 DNA限制酶切分析及其作圖 DNA分離純化 RNA分子鑒定與分型 血清蛋白電泳 瓊脂糖凝膠通常形成水平式板狀凝膠，用于等電聚焦、 免疫電泳等蛋白質(zhì)電泳。 （1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。 （2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%99%），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較 自由，對(duì)樣品吸附極微，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。 （3）瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測(cè)及定量測(cè)定。 （4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定，也易制成干膜長(zhǎng)期保存。 缺點(diǎn)

11、：缺點(diǎn)：電滲現(xiàn)象嚴(yán)重電滲現(xiàn)象嚴(yán)重 聚丙烯酰胺凝膠 應(yīng)用：應(yīng)用：不僅能分離、少量制備生物大分子，而且可以用來(lái)研究生物大分子 的性質(zhì)如電荷、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)以及構(gòu)象等。 聚丙烯酰胺凝膠電泳可用做蛋白質(zhì)純度的鑒定. 機(jī)械強(qiáng)度高，便于操作和保存；透明，便于照相和復(fù)印 原料成分純度高，制凝膠的重復(fù)性好 凝膠孔徑可調(diào)，用于分離不同分子量的生物大分子。 化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好 電滲作用小 把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，電泳分辨率高 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：高濃度凝膠難剝離 特點(diǎn)：特點(diǎn)：聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)具有聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)具有電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)和和分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)， 可以將分子大小相同而帶不同數(shù)

12、量電荷的物質(zhì)分離開(kāi)，并且可以將分子大小相同而帶不同數(shù)量電荷的物質(zhì)分離開(kāi)，并且 還可以將帶相同數(shù)量電荷而分子大小不同的物質(zhì)分離開(kāi)。其還可以將帶相同數(shù)量電荷而分子大小不同的物質(zhì)分離開(kāi)。其 分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般層析方法和電泳方法，可以檢出分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般層析方法和電泳方法，可以檢出10-9 10-12g的樣品，且重復(fù)性好，的樣品，且重復(fù)性好，沒(méi)有沒(méi)有電滲電滲作用作用. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 應(yīng)用應(yīng)用： 是最常用的定性分析蛋白質(zhì) 的電泳方法，根據(jù)遷移率大 小測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量。 常應(yīng)用于提純蛋白質(zhì)過(guò)程中 純度的檢測(cè)，純化的蛋白質(zhì) 通常在SDS電泳上只有一條 帶。 用一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白很易測(cè)得未 知

13、蛋白質(zhì)的分子量 特點(diǎn)特點(diǎn)： 儀器設(shè)備簡(jiǎn)單 操作方便、耗時(shí)少 樣品用量少 分辨率高、重復(fù)效果好 SDSPAGE電泳后，蛋白質(zhì)是變性的， 無(wú)活性但有抗原性，可用于western blotting（蛋白印跡）。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 所測(cè)得的分子量是單條肽鏈的分子量， 對(duì)寡聚蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，還要參照其它測(cè)定 分子量的方法。 對(duì)帶有較大輔基的蛋白質(zhì)，此結(jié)果不準(zhǔn) 確。 對(duì)電荷或構(gòu)象異常的蛋白不適用 SDS的存在影響染色 雙向凝膠電泳 這是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高，信息量最多的技術(shù)（蛋 白爆炸技術(shù)），已成為分析復(fù)雜蛋白混合物的基本工具 樣品經(jīng)過(guò)電荷與質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后可得到分子的等電點(diǎn)、分子量等信 息。 膠性 PH9

14、 中電 加解 入質(zhì) 了溶 雙液 PH3 加上電 場(chǎng)后建 立穩(wěn)定 PH梯 度 蛋白 質(zhì)溶 液加 入， 建立 電場(chǎng) 染色后， 蛋白質(zhì)因 PI值不同， 沿PH梯度 分離開(kāi) 第二向 SDS聚 丙烯酰胺 凝膠電泳 PI 逐漸降 低 06-07 雙向凝膠電泳示意圖雙向凝膠電泳示意圖 P I 逐 漸 降 低 分子 量逐 漸降 低 雙向凝膠電泳的應(yīng)用 06-21 LDH 同工酶電泳圖譜同工酶電泳圖譜 應(yīng)用：應(yīng)用： 雙向電泳是現(xiàn)在后基因組，蛋白質(zhì)組研究 的重要手段，雙向電泳常與質(zhì)譜聯(lián)用 雙向凝膠電泳電泳用于臨床上常見(jiàn)的同工 酶或同工酶亞型分析。如： 1乳酸脫氫酶(LD/LDH)同工酶； 2肌酸激酶（CK）同工酶

15、； 3CK同工酶亞型。 免疫電泳 將抗原樣品在瓊脂平板上先進(jìn)行電泳，使其中的各種 成分因電泳遷移率的不同而彼此分開(kāi)，然后加入抗體 做雙相免疫擴(kuò)散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊 脂中擴(kuò)散而相遇，在二者比例適當(dāng)?shù)牡胤?，形成肉?可見(jiàn)的沉淀弧沉淀弧。 免疫電泳擴(kuò)散模式圖 白蛋白A1b；球蛋白1區(qū)、2區(qū)、區(qū)和區(qū) 免疫固定電泳圖譜免疫固定電泳圖譜 瓊脂平板電泳 雙相免疫擴(kuò)散 免疫電泳 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 一是加快了沉淀反應(yīng)的速度 二是將某些蛋白組分利用其帶 電荷的不同而將其分開(kāi)，再分別 與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微細(xì)微的分 析。 毛細(xì)管電泳 溶液中的帶電粒子以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，沿毛細(xì)管通道，以不同速度向與其 所

16、帶電荷相反的電極方向遷移，并依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上 的差異 而實(shí)現(xiàn)分離。 特點(diǎn)特點(diǎn): 1. 高靈敏度 2. 高速度 3. 高分辨率 4. 樣品少 5. 自動(dòng)化程度高 6. 應(yīng)用范圍廣 電泳儀電泳儀 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 毛細(xì)管電泳 應(yīng)用應(yīng)用: 適用于分離、測(cè)定肽類(lèi)、蛋白質(zhì)、DNA類(lèi)物質(zhì)； 毛細(xì)管電泳可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀 毛細(xì)管電泳芯片可以進(jìn)行DNA長(zhǎng)度分析、序列分析和基因分型等研 究。 分離多種金屬陽(yáng)或多種陰離子，環(huán)境監(jiān)測(cè)方面發(fā)揮作用 檢測(cè)體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析； 分離各種藥物和臨床檢測(cè)，鑒定違禁藥物（毛細(xì)管區(qū)帶電泳） 毛細(xì)管電泳分離分析手性化合物 是利用芯片分離熒光標(biāo)記的寡核苷酸，。 利用凝膠毛細(xì)管的原理開(kāi)發(fā)了