Westernblot轉(zhuǎn)膜整個過程

1、轉(zhuǎn)膜 (Trarsmembra n )i轉(zhuǎn)膜的定義將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體(例如 NC膜)上，通常有兩種 方法：毛細(xì)管印跡法和 電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有 濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者 的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。前者操 作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。2轉(zhuǎn)移膜的選擇雜交膜的選擇是決定 Westernblot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋 白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于 Westernblot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC)和PVDF膜。NC膜是蛋白 印跡實驗的標(biāo)準(zhǔn)

2、固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的 蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。 根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同 孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。 通常用0.45 m和0.2 pm兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45 pm的膜, 小于20kD的蛋白就要用0.2 pm的膜了，如用0.45 pm的膜就會發(fā)生Blowthrough ”的現(xiàn)象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高， 非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇浸泡

3、飽和 1-5秒鐘。最常用于 WesternBlot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素(Nitrocellulose,NC )膜和聚 偏二氟乙烯(PolyvinylideneFluoride,PVDF )膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維 素膜做蛋白印跡。尼龍膜和NC膜的特點相似,主要用于核酸雜交。硝酸纖維素(nitrocellulose,NC )膜：NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活 化，對蛋白質(zhì)的活性影響小；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。但結(jié) 合在NC上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時易丟失；NC韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜：與蛋白質(zhì)親

4、和力高，用前需在甲 醇中浸泡，以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。膜的選擇主要根據(jù)：p膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力(也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量)，以 及膜的孔徑(也就是攔截蛋白的大小)；p不影響后續(xù)的顯色檢測(也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好)；p如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目 的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。幾種膜的性質(zhì)對比PVDF 膜NC膜尼龍膜背景低低較高蛋白結(jié)合能力100-200 pg/cm280-100 pg/cm2400ug/cm2機械強度強干的膜很脆軟而結(jié)實溶劑抗性強差差使用前處理甲醛潤濕緩沖液潤濕緩沖液潤濕價格高較低低3轉(zhuǎn)

5、膜步驟（以槽式濕轉(zhuǎn)為例）1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜 需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。（先把PVDF膜在甲醇中浸泡約15s，小于1min， 然后把膜放在1X轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡，然后上面鋪2層濾紙浸泡）3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕 去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅 面），（因為電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊 放一塊冰

6、來降溫），加轉(zhuǎn)移緩沖液， 插上電極，100V，1h （電流 350mA，1h30min ）。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。4轉(zhuǎn)膜注意事項1. 泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min ；a. 凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo) 致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。b. PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。2. 轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板；3. 轉(zhuǎn)膜條件：0.35A/250V/1h/40min/冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜過程產(chǎn)生大量的熱， 注意冷卻）；

7、（具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短。）4. 其它注意事項：a. 避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并 會使膜臟掉。b. 夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜 不完全。c. 保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率。d. 雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較高的背景，故 如果選擇雞來源的抗體最好使用硝酸纖維素膜（NC膜）。5轉(zhuǎn)膜后檢測（此步可以省略）轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的TBST （或PBST）中漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)， 通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色 液或硬度墨汁染色液對膜進(jìn)行染色， 以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮 藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。 a.麗春紅染色：蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾 次。b.印度墨汁染色：只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Wes