第4章電泳技術(shù)

1、電泳技術(shù) 目 錄 第一節(jié)區(qū)帶電泳 第二節(jié)等電聚焦電泳 第三節(jié)SDS-PAGE電泳 第四節(jié)二維電泳 第五節(jié)印跡技術(shù) 第六節(jié)免疫電泳 第七節(jié)高效毛細(xì)管電泳技術(shù) 第八節(jié)電泳分析儀 基本原理 不同性質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)，由于帶電性質(zhì)及電量不同，在 一定電場強(qiáng)度下移動(dòng)的方向和速度亦不同。 蛋白質(zhì)分子為兩性電解質(zhì) 等電點(diǎn) pH等電點(diǎn) 帶負(fù)電 pH等電點(diǎn) 帶正電 質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量越多（介質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量越多（介質(zhì)的pH值離等電點(diǎn)越值離等電點(diǎn)越 遠(yuǎn)）遠(yuǎn)） 質(zhì)點(diǎn)的直徑越小質(zhì)點(diǎn)的直徑越小 越接近球形越接近球形 則它在電場中的泳動(dòng)速度越快，遷移率亦越大。則它在電場中的泳動(dòng)速度越快，遷移率亦越大。 基本原理 區(qū)帶電泳 檢驗(yàn)醫(yī)

2、學(xué)中的應(yīng)用血清蛋白電泳 圖圖 6-1 6-1 正常血清蛋白電泳圖譜正常血清蛋白電泳圖譜 上圖：箭頭示電泳方向，右側(cè)示各條帶的主要組分；上圖：箭頭示電泳方向，右側(cè)示各條帶的主要組分； 下圖：光密度掃描后電泳圖譜；下圖：光密度掃描后電泳圖譜；HPHP：觸珠蛋白；：觸珠蛋白；CPCP：銅藍(lán)蛋白：銅藍(lán)蛋白 Alb：清蛋白：清蛋白 1：1酸性糖蛋白、1抗胰蛋白酶 2：HP、CP、2巨球蛋白、脂蛋白 ：運(yùn)鐵蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)、：運(yùn)鐵蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)、脂蛋白 ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE 區(qū)帶電泳 圖圖6-2 6-2 幾種常見異常血清蛋白圖譜幾種常見異常血清蛋白圖譜 A A：雙清蛋白血清電泳圖；：雙清

3、蛋白血清電泳圖；B B：慢性肝病或肝硬變常見的：慢性肝病或肝硬變常見的 - - 融融 合的橋連現(xiàn)象；合的橋連現(xiàn)象；C C：免疫球蛋白寡克隆增生型；：免疫球蛋白寡克隆增生型；D D：M M蛋白血清蛋白血清 型（型（IgAIgA型）；型）；N N：正常對照血清；：正常對照血清；P P：患者血清：患者血清 A B C D 區(qū)帶電泳 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 同工酶電泳 圖圖6-3 LDH6-3 LDH同工酶區(qū)帶電泳圖譜同工酶區(qū)帶電泳圖譜 左：左：5 5份血清份血清iso-LDHiso-LDH電泳圖；右：電泳圖；右：iso-LDHiso-LDH電泳示意圖電泳示意圖 第一節(jié) 區(qū)帶電泳 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 同工酶電

4、泳 圖圖6-4 CK6-4 CK同工酶示意圖同工酶示意圖 左：血清左：血清iso-CKiso-CK電泳圖，電泳圖，3 3示正示正 常血清（常血清（CK MB5%CK MB5%CK MB5%）；）；4 4示示 CK BBCK BB陽性；陽性； 右：右：iso-CKiso-CK電泳圖譜示意圖電泳圖譜示意圖 區(qū)帶電泳 實(shí)驗(yàn)原理 讓pHpI（max） 所有蛋白質(zhì)帶負(fù)電 各種蛋白質(zhì)帶電量不同 電泳速度不同 經(jīng)過一段時(shí)間電泳后，各種蛋白質(zhì)被區(qū)分開 區(qū)帶電泳 圖圖 6-1 6-1 正常血清蛋白電泳圖譜正常血清蛋白電泳圖譜 上圖：箭頭示電泳方向，右側(cè)示各條帶的主要組分；上圖：箭頭示電泳方向，右側(cè)示各條帶的主要

5、組分； 下圖：光密度掃描后電泳圖譜；下圖：光密度掃描后電泳圖譜；HPHP：觸珠蛋白；：觸珠蛋白；CPCP：銅藍(lán)蛋白：銅藍(lán)蛋白 Alb：清蛋白：清蛋白 1：1酸性糖蛋白、1抗胰蛋白酶 2：HP、CP、2巨球蛋白、脂蛋白 ：運(yùn)鐵蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)、：運(yùn)鐵蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)、脂蛋白 ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE 第二節(jié) 等電聚焦電泳 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用次級同工酶的分離 圖圖 6-5 6-5 堿性磷酸酶同工酶等電聚焦電泳圖譜堿性磷酸酶同工酶等電聚焦電泳圖譜 左：左：iso-ALPiso-ALP等電聚焦示意圖；右：膽道梗阻性疾病等電聚焦示意圖；右：膽道梗阻性疾病iso-ALPiso-ALP電泳圖譜電泳

6、圖譜 第二節(jié) 等電聚焦電泳 區(qū)帶電泳的原理是不同的蛋白質(zhì)有不同的電泳速度 那么可不可以有另外一種方法：使得不同蛋白質(zhì)在 泳道中本來就有“固定”位置，蛋白質(zhì)在相應(yīng)的位 置上停留？ 蛋白質(zhì)如何能夠停止電泳？ 除了切斷電源之外？ 蛋白質(zhì)不帶電了蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)溶液中 第二節(jié) 等電聚焦電泳 基本原理 在等電聚焦電泳時(shí)必須有一個(gè)穩(wěn)定的pH梯度介 質(zhì)，使pH值從正極向負(fù)極漸次增加，形成一線性 pH梯度。 蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的電泳管中，在電 場中經(jīng)一定時(shí)間后，混合物中各組分將分別聚焦在 與各等電點(diǎn)相應(yīng)的pH介質(zhì)區(qū)域，形成分離的各種 蛋白質(zhì)區(qū)帶。這就是等電聚焦電泳分離蛋白質(zhì)的基 本原理。 第三節(jié) SD

7、S-PAGE電泳 等電聚焦根據(jù)等電點(diǎn)將蛋白質(zhì)分離 那還能不能根據(jù)其他性質(zhì)將蛋白質(zhì)分離? 區(qū)帶電泳的電泳速度的影響條件較多（大小、 電荷、形狀），不是根據(jù)單一性質(zhì)分離 有一種方法能根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量使之帶上相 應(yīng)的電荷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)本身電荷的大小， 并使電荷成為電泳速度的主要決定因素，那么 電泳速度只和分子量相關(guān) 第三節(jié) SDS-PAGE電泳 SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)負(fù) 載了大量負(fù)電荷，大大超過了天然蛋白質(zhì)的原 有電荷，因此蛋白質(zhì)之間原有電荷的差異就無 顯著效應(yīng)，蛋白質(zhì)帶電量的多少，只與蛋白質(zhì) 大小即分子量有關(guān)，此時(shí)，不同泳動(dòng)速率僅反 映了各蛋白質(zhì)亞基的分子量的差別。 第三節(jié)

8、SDS-PAGE電泳 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用非濃縮尿蛋白電泳 圖圖 6-7 6-7 非濃縮尿蛋白電泳非濃縮尿蛋白電泳 示意圖示意圖 第三節(jié) SDS-PAGE電泳 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用非濃縮尿蛋白電泳 圖圖 6-8 6-8 臨床常見蛋白尿電泳圖譜臨床常見蛋白尿電泳圖譜 左：腎小球性蛋白尿；左：腎小球性蛋白尿； 中：腎小管性蛋白尿，泳道中：腎小管性蛋白尿，泳道4 4示混合性蛋白尿，腎小管性蛋白尿?yàn)橹餍停皇净旌闲缘鞍啄?，腎小管性蛋白尿?yàn)橹餍停?右：混合型蛋白尿右：混合型蛋白尿 一個(gè)條帶中仍是混合著多種蛋白 質(zhì)，如何再把它們分開呢？ 第四節(jié) 二維電泳 圖圖 6-9 6-9 二維電泳原理及流程圖二維電泳原理及流程

9、圖 第四節(jié) 二維電泳 基本原理 第一維電泳，即等電聚焦電泳(isoelectric focusing，IEF)其基本原理是利用蛋白質(zhì) 分子等電點(diǎn)的不同對其進(jìn)行分離； 第二維電泳，即SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，使電泳遷移率主要取決于蛋 白質(zhì)或亞基分子量的大小。 第四節(jié) 二維電泳 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 一個(gè)問題：如何確定某個(gè)條帶是 什么蛋白質(zhì)？ 圖圖 6-1 6-1 正常血清蛋白電泳圖譜正常血清蛋白電泳圖譜 上圖：箭頭示電泳方向，右側(cè)示各條帶的主要組分；上圖：箭頭示電泳方向，右側(cè)示各條帶的主要組分； 下圖：光密度掃描后電泳圖譜；下圖：光密度掃描后電泳圖譜；HPHP：觸珠蛋白；：觸

10、珠蛋白；CPCP：銅藍(lán)蛋白：銅藍(lán)蛋白 第五節(jié) 印跡技術(shù) 免疫印跡法基本原理 圖圖 6-13 6-13 免疫印跡法的原理免疫印跡法的原理 第五節(jié) 印跡技術(shù) 免疫印跡法（Immunoblotting） 又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blot) ，因與早 先建立的檢測核酸的Southern blot 相類似， 亦被稱為Western blot，是一種借助特異性抗 體鑒定抗原的有效方法。被檢測物是蛋白質(zhì)， “探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記二抗。 第五節(jié) 印跡技術(shù) 共分三個(gè)階段進(jìn)行 SDS-PAGE 電轉(zhuǎn)移 酶免疫定位 第五節(jié) 印跡技術(shù) 免疫印跡法在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 自身抗體檢測中的應(yīng)用 第五節(jié) 印跡技

11、術(shù) 圖圖 6-14 6-14 免疫印跡法在自身抗體免疫印跡法在自身抗體ENAENA檢測中的應(yīng)用檢測中的應(yīng)用 第六節(jié) 免疫電泳 電泳技術(shù)與免疫技術(shù)相結(jié)合，大大擴(kuò)大了 其臨床應(yīng)用的范圍，于1953年Grabar和 Williams首次將凝膠擴(kuò)散置于直流電場中進(jìn)行， 讓電流來加速抗原與抗體的擴(kuò)散并規(guī)定其運(yùn)行 方向，并與免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合,該技術(shù)有兩大 優(yōu)點(diǎn)，一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某 些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分離開， 再分別與其對應(yīng)抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分 析。 第六節(jié) 免疫電泳 對流免疫電泳(CIEP) 圖圖 6-15 6-15 對流免疫電泳示意圖及應(yīng)用（對流免疫電泳示意圖及應(yīng)

12、用（1 1：陽性；：陽性；2 2：弱陽性；：弱陽性；3/43/4：強(qiáng)陽性）：強(qiáng)陽性） 第六節(jié) 免疫電泳 火箭免疫電泳(RIE) 實(shí)驗(yàn)原理： 在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加 入待測標(biāo)本后，將抗原置陰極端，用橫距2 3mA/cm的電流強(qiáng)度進(jìn)行電泳?？乖鞠蜿枠O， 在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳 動(dòng)抗原的減少，抗原泳動(dòng)的基底區(qū)越來越窄， 抗原抗體復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成 一個(gè)狀如火箭的沉淀峰。 第六節(jié) 免疫電泳 火箭免疫電泳(RIE) 圖圖 6-16 Laurell 技術(shù)示意圖及火箭免疫電泳圖譜技術(shù)示意圖及火箭免疫電泳圖譜 Ag：抗原；：抗原；1、2、3為待測標(biāo)本；為待測標(biāo)本

13、；4、5、6為標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn) 第六節(jié) 免疫電泳 火箭免疫電泳(RIE)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 火箭電泳放射自顯影定量甲胎蛋白 圖圖 6-17 6-17 火箭電泳放射自顯影定量檢測火箭電泳放射自顯影定量檢測AFPAFP圖譜圖譜 第六節(jié) 免疫電泳 火箭免疫電泳(RIE)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 血清脂蛋白ApoA1和ApoB火箭電泳 圖圖 6-18 血清脂蛋白血清脂蛋白ApoA1和和ApoB火箭電泳分析圖譜火箭電泳分析圖譜 1、2、3、4、5示標(biāo)準(zhǔn)；示標(biāo)準(zhǔn)；6、7、8示待測標(biāo)本示待測標(biāo)本 第六節(jié) 免疫電泳 免疫電泳(IEP )技術(shù) 是區(qū)帶電泳與免疫雙擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫化 學(xué)分析技術(shù)。 第六節(jié) 免疫電泳 免疫電泳(

14、IEP)技術(shù)基本原理 第六節(jié) 免疫電泳 免疫電泳(IEP )技術(shù)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 表表1 1 血漿免疫電泳各區(qū)帶所含蛋白成分血漿免疫電泳各區(qū)帶所含蛋白成分 Alb12 前白蛋白前白蛋白 白蛋白白蛋白 1 1- -抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶 1 1- -酸糖蛋白酸糖蛋白 1 1- -抗糜蛋白酶抗糜蛋白酶 1 1- -脂蛋白脂蛋白 甲胎蛋白甲胎蛋白 觸珠蛋白觸珠蛋白 銅藍(lán)蛋白銅藍(lán)蛋白 2 2- -巨球蛋白巨球蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白 C3C3、C4C4 脂蛋白脂蛋白 2 2- -微球蛋白微球蛋白 纖維蛋白原纖維蛋白原 C C反應(yīng)蛋白反應(yīng)蛋白 免疫球蛋白免疫球蛋白 第六節(jié) 免疫電泳 第六節(jié) 免疫電泳 免疫固

15、定電泳(IFE)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 圖圖 6- 21 6- 21 血清免疫固定電泳圖血清免疫固定電泳圖 左：左：IgA-型型M蛋白；右：雙蛋白；右：雙M蛋白（蛋白（IgG-、IgA-） 第六節(jié) 免疫電泳 免疫固定電泳(IFE)技術(shù)優(yōu)勢 周期短 敏感性高 分辨率好 結(jié)果易分析 第七節(jié) 高效毛細(xì)管電泳技術(shù) 基本原理 電電 滲滲 流流 + + 圖圖 6-23 6-23 高效毛細(xì)管電泳原理圖高效毛細(xì)管電泳原理圖 第七節(jié) 高效毛細(xì)管電泳技術(shù) 高效毛細(xì)管電泳的分離模式 毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (capillary zone electrophoresis, CZE) 毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis, CGE） 膠束電動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管色譜（micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC) 等電聚焦電泳（isoelectric focusing, IEF) 等速聚焦電泳 (isotachophoresis, ITP) 毛細(xì)管電色譜（capillary electrochromatography, CEC） 親和毛細(xì)管電泳（affinity capillary electrophoresis, ACE） 電動(dòng)色譜(electroki