[DOC] 一株從銀杏內(nèi)種皮分離的細菌的鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶研究

1、一株從銀杏內(nèi)種皮分離的細菌的鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶研究北麈業(yè)掌揠2o11,20(9):174179actaagriculturaeborealioccidentalissinica一株從銀杏內(nèi)種皮分離的細菌的鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶研究李婷婷,蔡宇杰,廖祥(1.江南大學,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫儒,尹靜,張大兵.214122;2.江蘇漢邦科技有限公司,江蘇淮安223001)摘要:應(yīng)用形態(tài)學,生理生化和16srrna基因序列分析方法,鑒定從銀杏內(nèi)種皮分離得到的一株細菌;并利用液態(tài)發(fā)酵法探討碳,氮源等對該菌產(chǎn)過氧化氫酶的影響.結(jié)果顯示,該菌可歸人沙雷氏菌屬,其最適碳源為葡萄糖,最適

2、氮源為玉米漿粉;胞內(nèi)產(chǎn)過氧化氫酶為低溫過氧化氫酶,產(chǎn)量可達8062.22u/ml發(fā)酵液關(guān)鍵詞:過氧化氫酶;細菌鑒定;發(fā)酵;serratiamarcescenssybcto2中圖分類號:q93文獻標志碼:a文章編號:10041389(2011)09017406identificationofabacteriumisolatedfromtheendopleuraofginkgobilobal.anditsfermentationforcatalaseproductionlitingting,caiyujie,liaoxiangru,yinjingandzhangdabing(1.thekeylab

3、oratoryofindustrialbiotechnology,ministryofeducation,schoolofbiotechnology,jiangnanuniversitywuxijiangsu214122,china;2.jiangsuhanbonscience&technologyco.ltd,huaianjiangsu223001,china)abstract:morphologicalaspects,physiologicalandbiochemicalcharactersand16srrnasequenceanalysiswereusedtoidentifyth

4、ebacteriumisolatedfromtheendopleuraofginkgobilobal.andliquidstatefermentationwasutilizedtoevaluatetheeffectofcarbonandnitrogenresourcesandotherfactoronitscatalaseproduction.thedatashowedthatthebacteriumisolatedwasbelongedtothegenusserratiaanddesignatedasserratiamarcescenssybct02,theoptimalcarbonandn

5、itrogenresourcewasglucoseandcornsteeppowder,andtheyieldofintrocellularcatalasewascoldadaptedcatalaseandcouldreach8062.22u/ml.keywords:catalase;bacteriumidentification;fermentation;serratiamarcescenssybct02隨著社會環(huán)境保護意識的增強,過氧化氫在紙漿漂白,紡織和食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)得到廣泛認同_1.但過氧化氫本身對生物也有極大危害,因此如何分解工業(yè)加工中過多的過氧化氫已經(jīng)受到世界各國的關(guān)注.

6、過氧化氫酶高效,專一催化過氧化氫分解為氧氣和水,但其在環(huán)境保護中的應(yīng)用受到其生產(chǎn)原料和成本的極大限制.過氧化氫酶廣泛存在于不同生物的細胞中3,依據(jù)其酶學特性,可將細菌的過氧化氫酶分為3種e:含血紅素的單功能過氧化氫酶,含血紅素的雙功能過氧化氫酶,和不含血紅素的過氧化氫酶.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多好氧或兼性好氧細菌有較高的產(chǎn)過氧化氫酶能力,如escherichiacoli_5,bacillussubtilis,streptomycescoelicolore7-8,根瘤菌,azotobactervinelandiil1等.也有研究報道,從嗜鹽l_】,嗜熱口.和嗜冷微生物l1.i_中可分離得到一些酶學性質(zhì)獨特的

7、過氧化氫酶.尤其是低溫過氧化氫酶,可用于低溫下催化環(huán)境中過氧化氫降解,有利于節(jié)約能源.但低溫酶往往穩(wěn)定性差,低溫酶產(chǎn)生菌多為嗜冷菌,其生收稿日期:20101012修回日期:20101205基金項目:國家”863”計劃項目(2010aa101501).第一作者:李婷婷,女,碩士研究生,研究方向為生物大分子的結(jié)構(gòu),功能與制備.通訊作者:廖祥儒,博士,教授,博士生導師.期李婷婷等:一株從銀杏內(nèi)種皮分離的細菌的鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶研究長緩慢,低溫酶異源表達也較困難1.本試驗從銀杏內(nèi)種皮分離得到一株高產(chǎn)低溫過氧化氫酶的嗜溫細菌,并對其進行鑒定,初步研究其發(fā)酵產(chǎn)酶情況和粗酶性質(zhì).1材料與方法1.1菌株

8、分離銀杏種子經(jīng)體積分數(shù)為7o乙醇浸泡1rain后,用無菌小鉗打開后取內(nèi)種皮呈紅色的種子;用無菌的鑷子剝?nèi)〖t色內(nèi)種皮,置于含25mllb培養(yǎng)基(蛋白胨10g/l,酵母膏5g/l,nac110g/l,ph7.o)的三角瓶中,在30oc200r/rain下震蕩培養(yǎng)20h.將培養(yǎng)物稀釋1o.倍,涂布于lb平板,挑取單菌落再劃線于lb平板,挑取單菌落保存于lb斜面培養(yǎng)基中備用.1.2形態(tài)學和生理生化特征鑒定將篩選到的菌株劃線于lb固體培養(yǎng)基,3o培養(yǎng)12d,觀察單菌落形態(tài).并在電子顯微鏡下觀察菌株的細胞形態(tài).參照文獻17和e18中的方法進行生理生化鑒定.脂肪酸組成采用hplc法進行分析.1.316srr

9、na的pcr擴增及分析細菌總dna的提取見參考文獻19.以細菌dna為模板,519f:5一cagcagccgcggtaatac一3和519r:5一cgattactagcgattcc一3do,分別進行擴增.pcr反應(yīng)條件為:95預變性4min,94變性1min,52退火1rain,72延伸復性90s,35個循環(huán)后于72繼續(xù)延伸6rain,12保溫10rain.pcr產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成.將測序結(jié)果在ncbi中進行blast后交送genbank,與其中已有序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析.1.4發(fā)酵產(chǎn)酶1.4.1種子培養(yǎng)250ml的三角瓶裝液量為50ml,從平板接人一環(huán)菌,30下于旋

10、轉(zhuǎn)式搖床200r/min搖瓶培養(yǎng)8h.1.4.2發(fā)酵產(chǎn)酶在250ml的三角瓶裝液50ml,接人培養(yǎng)8h的種子菌懸液,接種體積分數(shù)為1o,旋轉(zhuǎn)式搖床200r/rain搖瓶發(fā)酵,不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10h.1.4.3酶的制備取一定量發(fā)酵液在108oog條件下冷凍離心15rain,菌泥以50mmol/l的k2hpokhzpo緩沖液(ph7.o)洗滌2次,以適量相同的緩沖液重懸后置冰浴預冷.超聲波破碎(工作1s,停3s,總工作時間為10rain,功率為300w),在15000g冷凍離心20min,上清液即為胞內(nèi)過氧化氫酶粗酶液.1.5過氧化氫酶活力測定參考錢斯亮等21的方法,酶活力定義為1rain分解1

11、blmolh2o所需酶量為1個酶活力單位(u).1.6數(shù)據(jù)分析采用軟件ssps12.5進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)來自最少3個獨立試驗,并各有至少3個重復.2結(jié)果與分析2.1菌落和細菌形態(tài)菌株在lb固體培養(yǎng)基上3o培養(yǎng)1d后出現(xiàn)紅色菌落,2d后菌落顏色加深,呈深紅色,菌落直徑約4mm,不透明,圓形,中間稍隆起,粘稠,邊緣整齊光滑.培養(yǎng)的細胞經(jīng)掃描電鏡觀察,細胞呈短桿狀,長約1.5m,直徑約0.5m,端圓(圖1).其菌落形態(tài)和細胞形態(tài)符合沙雷氏菌屬的特征.2.2菌株的生理生化鑒定結(jié)果由表1可知,該菌為革蘭氏陰性,vp反應(yīng)陽性,接觸酶反應(yīng)陽性,能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸,其大部分生理生化特性與格氏沙雷氏菌(se

12、rratiamarcescens)最為接近,但與粘質(zhì)沙雷氏菌也很相近;而其利用蔗糖,乳糖產(chǎn)酸時,與格氏沙雷氏菌略有不同.由表2可知,該菌的主要脂肪酸為16:0(17.19),10:030h(15.51),17:0cyclo(11.76),14:030h/16:1isoi(10.77)和圖1serratiamarcescenssybct02菌株的電鏡照片fig.1electronicmicroscopediagramofthestrainserratiamarcescenssybct02?176?西北農(nóng)業(yè)2o卷表1serratiamarcescenssybct02菌株的生理生化特征table1t

13、hephysiologicalandbiochemicalcharactersofthestrainserratiamarcescenssybct02注:+為陽性,一為陰性,d為棕色(弱陽性).note:+meanspositive,一meansnegative,dmeansbrown(weakpositive)一種未知成分(11.o1),與鑒定的其他沙雷氏菌均不相同,因此將其命名為serratiasybct02.2.3分子鑒定提取總dna,以primera和primerb為引物擴增菌株serratiasybct02的16srrna基因部分片段.測序結(jié)果顯示,序列與serratiamarces

14、cens的16srrna基因的相似性超過99.根據(jù)s.marcescens的16srrna基因序列設(shè)計引物primer01和primer02,pcr擴增獲得1505個堿基的基本完整序列,利用blast軟件將該序列(待提交genbank)與genbank中收集的所有細菌基因進行比對,結(jié)果顯示serratiasybct02的16srrna基因序列與serratiamarcescensstraina3的16srrna基因序列相似性最高,為99.9,結(jié)合生理生化等特性,確定serratiasybct02屬于serratiamarcescens,因此最終定名為serratiamarcescenssybc

15、t02.2.4碳源對發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶的影響分別以等摩爾碳的淀粉,葡萄糖,果糖,麥芽糖,乳糖和蔗糖為碳源,以蛋白胨為氮源發(fā)酵,菌株產(chǎn)過氧化氫酶水平不盡相同(圖2).其中以葡萄糖為碳源時最有利于該菌產(chǎn)過氧化氫酶,其次為蔗糖,再就是麥芽糖和果糖,作用最小的是淀粉和乳糖.2.5氮源對發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶的影響以葡萄糖為碳源,分別以等摩爾氮的蛋白胨,酵母膏,牛肉膏,玉米漿粉,豆粕,尿素和茶籽粕為氮源發(fā)酵,菌株產(chǎn)過氧化氫酶的情況如圖3所示.結(jié)果表明,玉米漿粉最有利于該菌產(chǎn)過氧化氫酶,其次為蛋白胨和酵母膏,再者為牛肉膏,尿素,茶籽粕不利于產(chǎn)酶.2.6溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響以葡萄糖和玉米漿粉分別為碳源和氮源的培養(yǎng)基

16、,在不同溫度下震蕩培養(yǎng)10h,菌株發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶的情況見圖4.圖4說明該菌產(chǎn)過氧化氫酶的最適溫度為33,與其最適生長溫度相近.l23456碳源carbonsources1.淀粉starch;2.葡萄糖glucose;3.果糖fructose;4.麥芽糖maltose;5.乳糖lactose;6.蔗糖sucrose圖2碳源對serratiamarcescenssybct02產(chǎn)過氧化氫酶的影響fig.2efctofcarbonresourcesoncatalascidtype脂肪酸相對含量/relativecontentofacidsybc08sybct02注:sybc08為serratiama

17、rcescenssybc08,保存于中國科學院微生物研究所國家菌種保藏中心,編號為cgmcc3449.note:sybct08isserratiamarcescenssybc08,preservedinchinageneralmicr0bi0l0gicalculturecollectioncenter,anditsnesoncatalaseproductionofserratiamarcescenssybct021000080006000400020000溫度/temperature圖4溫度對serratiamarcescenssybct02產(chǎn)過氧化氫酶的影響fig.4effectoftemp

18、eratureoncatalaseproductionofserratiamarcescenssybct0212o100s.棼60靛薯tmicrococcuslysodeiktiouspenicilliumvariabileaspergillusnigersaccharomycescerevisiaepseudomonadvibriorumoiensis嗜熱子囊菌therlnoascu$aurantiacus中國科學院微生物研究所chinageneralmierobiologicalculturecollectioncenter江南大學jiangnanuniversity蘇州大學生命科學學院s

19、chooloflifesciences,suzhouuniversity意大利basilicata大學italybasilicatauniversity波蘭,mariacuriesklodowska大學mariacuriesklodowskauniversity印度,中央食品技術(shù)研究院india,centralinstituteoffoodtechnology瑞典,heinokuusksweden,heinokuusk日本,早稻田大學japan,wasedauniversity江南大學jiangnanuniversity14ou/ml185u/ml292u/ml735u/ml78u/ml104

20、u/g161u/ml321u/mg2762u/mlshakingflaskfermentation發(fā)酵罐fermenter搖瓶shakingflaskfermentation發(fā)酵罐fermenter發(fā)酵罐fermenter發(fā)酵罐fermenter搖瓶shakingflaskfermentation搖瓶shakingflaskfermentation發(fā)酵罐fermenter注:*表示每克濕菌體,*表示每毫克細胞.note:*meanscellstrainpergram,*meansceilspermilligram.2.7粗酶的特性分析由圖5,6可見,該菌過氧化氫酶最適ph為9,最適溫度為5o在

21、0時酶活為最適溫度的64.85,說明應(yīng)有低溫過氧化氫酶的存在.童羹溫度/temperature圖6溫度對serratiamarcescenssybct02過氧化氫酶活性的影響fig.6effectoftemperatureoncatalaseactivityofserratiamarcescenssybct023討論通過形態(tài)鑒定,生理生化特性比較和16srrna基因序列分析,從銀杏內(nèi)種皮分離得到的細菌sybct02既不同于格氏沙雷氏菌,也不同于現(xiàn)有的粘質(zhì)沙雷氏菌菌株,鑒于其16srrna基因序列明顯接近粘質(zhì)沙雷氏菌,將其歸屬于沙雷氏菌屬的粘質(zhì)沙雷氏菌,定名為serratiamarcescens

22、sybct02.從發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶的情況來看,菌株serratiamarcescenssybct02的最佳碳氮源分別為葡萄糖和玉米漿粉,最適溫度為33.在碳源和氮源分別為葡萄糖及玉米漿粉時,產(chǎn)酶可達到8062.22u/mi,比活力達613.24u/mg,與國內(nèi)外產(chǎn)過氧化氫酶菌株相比有一定優(yōu)勢e(表3).從粗酶的性質(zhì)來看,該菌所產(chǎn)過氧化氫酶為堿性過氧化氫酶,基于其在0時仍能保持最適溫度時的64.85,該菌應(yīng)該能夠產(chǎn)生低溫過氧化氫酶,相比于國內(nèi)外大多數(shù)過氧化氫酶菌株,更具備工業(yè)價值.因此,serratiamarcescenssybct02屬于能夠產(chǎn)低溫過氧化氫酶的嗜溫菌.至于該菌產(chǎn)過氧化氫酶的發(fā)酵

23、調(diào)控,所產(chǎn)酶的酶學性質(zhì)及分子特征等還有待進一步研究.參考文獻:eli劉冰,梁嬋娟.生物過氧化氫酶研究進展ej.中國農(nóng)學通報,2005,21(5):223224./-23zamockym.furtmullerpg,obinc.evolutionofcatalasesfrombacteriatohumansej.antioxidant8lredoxsignaling,2008,10:15271548.e33loshehaginov.kovalenkori.possibleroleofcatalaseinadaptationtodivingofsemiaquaticrodentsondatrazib

24、ethicaj.evolutionarybiochemistryandphysiology,2002,38:9095.r4cheilkanip,fitai,loewenpc.diversityofstructuresand9期李婷婷等:一株從銀杏內(nèi)種皮分離的細菌的鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶研究?179?esl67893101112i33propertiesamongcatalasesj.cellmollifesci,2004,61:192-208.claibornea,fridovichi.purificationoftheodianisidineperoxidasefromescherichi

25、acolibj.jbiolchem,1979,254:4245-4252.loewenpc,switalaj.multiplecatalasesinbacillussubtilisj.jbacteriol,1987,169:36013607.choyh,roejh.isolationandexpressionofthecatageneencodingthemajorvegetativecatalaseinstreptomycescoelicolormailerj.jbacteriol,1997,179:40494052.kim,hp,leejs,hahyc,eta1.characterizat

26、i0nofthemajorcatalasefromstreptomycescoelicoloratcc10147ej.microbiol,1994,140:339卜3397.hanyum?fujimotoh,tejimak,eta1.functionaldifferencesoftwodistinctcatalasesinmesorhizobiumlotimaff303099underfreelivingandsymbioticconditionsj.jbacteriol,2009,191:14631471.sandercockjr,pagewj.identificationoftwocata

27、lasesinazotobactervinelandii:akatghomologueandanovelbacterialeytochromeccatalase,cccavj.jbacteriol,2008,190:954962.brownpetersonnj,salinml.purificationandcharacterizationofamesophiliccatalasefromthehalophilicbacteriumhalobacteriurnhalobiumj.jbacteriol,1995,177:37884.lopraserts,negoros,okadah.thermos

28、tableperoxidasefrombacillusstearotherraophilusj.jgenmicrobiol,1988,134:19711976.kagawam,murakoshin.nlshikaway,eta1.purificationandcloningofathermostablemanganesecatalasefroma14151161731831912o2122thermophilicbacteriumj.archbiochembiophys,1999,362:346-355.yumotoi,ichihashid,1watah,eta1.purificationandcharacterizati0nofacatalasefromthefacuhativelypsy-chrophilicbacteri