還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法

1、還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法一、目的掌握還原糖和總糖測定的基本原理，學(xué)習(xí)比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計(jì)的使用。二、原理還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。 利用糖的溶解度不同， 可將植物樣品中的單糖、 雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量(還原糖以葡萄糖含量計(jì))。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基

2、-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系， 利用分光光度計(jì)，在540nm波長下測定光密度值， 查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算， 便可求出樣品中還 原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計(jì)3.S怕単水杷皺皿門算多糖含量時應(yīng)乘以 0.9。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1. 實(shí)驗(yàn)材料小麥面粉；精密pH試紙。2. 主要儀器(1) 具塞玻璃刻度試管：20mLX 11(2) 大離心管：50mLX2(3) 燒杯：lOOmlXl(4 )三角瓶：1OOmLX1(5 )容量瓶：100mLX3(6) 刻度吸管：1mb 1; 2mb2; 10mLX1(7)

3、恒溫水浴鍋(8) 沸水浴(9) 離心機(jī)(10 )扭力天平(11)分光光度計(jì)3. 試劑(1) 1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取80C烘至恒重的分析純葡萄糖1OOmg,置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后， 轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至1OOmL混勻，4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?2) 3,5-二硝基水楊酸(DNS試劑將6.3gDNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL,貯于棕色瓶中備用。(3) 碘-碘化鉀溶液：稱取 5g碘和10g碘化鉀，溶于100mL蒸餾水中。(4) 酚酞指示

4、劑：稱取 0.1g酚酞，溶于250mL703乙醇中。(5) 6M HCl 和 6M NaOH各 100mL四、操作步驟1. 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支20mL具塞刻度試管編號，按表 1分別加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸(DNS試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。i TFtES-if mL)(ml IDNS i tiiL 1me)先韋世位-001.501021 s1503y0 4lei 50.4J06i j1.50640&1 21.5OS1.01.01.061 20 s1.5foodmate, ne表1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作2. 樣品中還原糖和總糖的測定(1) 還原糖

5、的提取準(zhǔn)確稱取3.00g食用面粉，放入100mL燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入50mL蒸餾水，攪勻，置于 50C恒溫水浴中保溫 20min，使還原糖浸出。將浸出液(含沉淀)轉(zhuǎn)移 到50mL離心管中，于 4OOOr/min下離心5min,沉淀可用20mL蒸餾水洗一次，再離心，將 二次離心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。(2) 總糖的水解和提取準(zhǔn)確稱取1.00g食用面粉，放入 100mL三角瓶中，加15mL蒸餾水及10mL 6M HCI，置沸水 浴中加熱水解30min (水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查)。待三角瓶中的水解液冷卻 后，加入1

6、滴酚酞指示劑，用6mol/LNaOH中和至微紅色，用蒸餾水定容在100mL容量瓶中， 混勻。將定容后的水解液過濾，取濾液10mL,移入另一 100mL容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測液。(3) 顯色和比色取4支20mL具塞刻度試管，編號，按表2所示分別加入待測液和顯色劑，空白調(diào)零可使用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。A 3!料品還廉期1|臺Jrtk兌WH：開廉AtWDNSif 町* 1-mL mL1 mL “70.51.515Q.51.5151II 5totti 5五、結(jié)果與計(jì)算：計(jì)算出7、8號管光密度值的平均值和 9、10管光密度值的平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上分

7、別查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量。還原衲（%）=査|#1線所得葡萄料臨克敷斑取裁總淳林 測宜時取用體積樣品毫克數(shù)100總糖倫,M線所得水杠込原糖耿數(shù)蹄倍數(shù)“財樣品呈丸故i會員登錄|忘記密碼？設(shè)為首頁|加入桌面i rri收藏本頁|手機(jī)版|無圖版|_卞 歡迎，客人I免費(fèi)注冊 叱上網(wǎng)做生意，首選 VIP會員I 趨食品伙伴網(wǎng) www.food AJate .netHioii人才求購供應(yīng)公司首頁食品資訊政策法規(guī)生產(chǎn)技術(shù)質(zhì)量管理檢驗(yàn)技術(shù)儀器設(shè)備食品標(biāo)準(zhǔn)資料中心翻譯中心培訓(xùn)中心商務(wù)中心食品人才 食品安全 食品課堂 食品專題 食品網(wǎng)刊 食品網(wǎng)址 數(shù)據(jù)庫 知識堂會展中心 考試中

8、心 食品家園 食品論壇DS糖的測定方法核心提示：對于糖的測定方法有很多，大致可分為三類1.物理法，（1.旋光法，2 .折光法，3比重法,）2.物理化學(xué)法,（1.點(diǎn)位法旦對于糖的測定方法有很多，大致可分為三類1. 物理法，（1.旋光法,2 .折光法,3.比重法,）2. 物理化學(xué)法,（1 .點(diǎn)位法,2極普法,3.光度法,4.色譜法）3. 化學(xué)方法,（1.斐林氏法.2.高錳酸鉀法.3.碘量法.4.鐵氰化鉀法.5.蒽銅比 色法.6.咔唑比色法）共計(jì)三大種，在測定其他碳水化合物時，往往是使其水解為糖再進(jìn)行測定。一.總糖的測定食品中的總糖主要指具有還原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在測定條件下能水解為還原

9、性的單糖的蔗糖（水解后為1分子葡萄糖和1分子果糖），麥芽糖（水解后 為2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后為 2分子葡萄糖）。還原糖 類之所以具有還原性是由于分子中含有游離的醛基（-CHO或酮基（=C=0）。測定總糖的經(jīng)典化學(xué)方法都是以其能被各種試劑氧化為基礎(chǔ)的。這些方法中，以各種根據(jù)斐林氏溶液的氧化作用的改進(jìn)法的應(yīng)用范圍最廣。在這里我們主要給大 家介紹鐵氰化鉀法，蒽銅比色法，斐林氏容量法。斐林氏容量法由于反應(yīng)復(fù)雜， 影響因素較多，所以不如鐵氰化鉀法準(zhǔn)確，但其操作簡單迅速，試劑穩(wěn)定，故被 廣泛采用。蒽銅比色法要求比色時糖液濃度在一定范圍內(nèi)，但要求檢測液澄清，此外，在大多數(shù)情況下，測定要

10、求不包括淀粉和糊精，這就要在測定前將淀粉，糊精去掉，這樣就使操作復(fù)雜化，限制了其廣泛應(yīng)用。(一) 鐵氰化鉀法1. 原理：樣品中原有的和水解后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化糖都具有還原性質(zhì)，在堿性溶液中能將鐵氰化鉀還原，根據(jù)鐵氰化鉀的濃度和檢驗(yàn)滴定量可計(jì)算出含糖量。其反應(yīng)為下：GHi2Q+6K3Fe(CN)6 + 6KOH (CHOH) - (COOH) + 6K 4 Fe(CN)6】+ 4H2O滴定終了時，稍過量的轉(zhuǎn)化糖即將指示劑次甲基蘭還原為無色的隱色體。2, 試劑1) 1 %的次甲基蘭指示劑2) 鹽酸(水解作用)3) 10%和 30% 的 NaOH溶液4) 1 %鐵氰化鉀(貯存特色瓶，臨用前標(biāo)定)標(biāo)定步驟稱蔗

11、糖1.0000g 定容500ml取此液50ml于100ml容量瓶加hcl5ml 搖勻65-70 C水裕15分鐘取出冷卻用30% NaOF中和加水于刻度倒入滴定 管中取10ml1%鐵氰化鉀于錐形瓶中加 10% NaOH2.5m加 12.5ml的水加玻 璃珠顆粒加熱至沸保持一分鐘加次甲基蘭1滴立即以糖液滴足至藍(lán)色退去為止，記錄用量。正式滴定比較滴定時少0.5ml糖液，煮沸1分鐘，加指示劑一滴，再用糖液滴定 至蘭色褪去，計(jì)算鐵氰化鉀溶液的濃度。A=(W V)/(1000 X 0.95)A:相當(dāng)于10ml鐵氰化鉀溶液的轉(zhuǎn)化糖的量(克)V:滴定時消耗的糖液的體積W稱取純蔗糖的量1000:稀釋比0.95

12、:換算等數(shù)3 操作方法稀釋10g-用100ml水作溶液一于250ml容量瓶一加20%醋酸鉛10ml-至沉淀 完為止一加10ml10% NA2HPO4至不在產(chǎn)生沉淀為止一加水至刻度一過濾取 濾液50ml-于100ml容量瓶中一按鐵氰化鉀標(biāo)定法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，中和及滴定計(jì)算糖含量總糖(以轉(zhuǎn)化糖計(jì) % = (A X 1000)/(W - V) X100A:相當(dāng)于10ml鐵氰化鉀溶液的轉(zhuǎn)化糖的重量,W樣品的重量V:滴定時樣液消耗的體積 4 實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意（a）達(dá)終點(diǎn)時，過量的轉(zhuǎn)化糖將指示劑次甲基蘭還原為無色的隱色體，隱色體 容量受空氣中氧所氧化，很快又變成指示劑的顏色。（b）整個過程應(yīng)在低溫電爐上進(jìn)行，滴定要速

13、度，否則終點(diǎn)不明顯（c）糖與硫酸反應(yīng)脫水生成羥甲基呋喃甲醛，生產(chǎn)物再與蒽銅縮合成蘭色化合 物，其顏色深淺與溶液中糖的濃度成正比，單、雙糖等糖類都直接于試劑發(fā)生作用，因此不需要水解。（二）蒽銅的比色法1. 原理：糖與硫酸反應(yīng)脫水生成羥甲基呋喃甲醛，生產(chǎn)物再與蒽銅縮合成蘭色化合物，其顏色深淺與溶液中糖的濃度成正比，可比色定量。2. 試劑（1）硫酸鋅溶液：溶解500g化學(xué)純硫酸鋅于500ml水中（2） 亞鐵氰化鉀溶液：溶解10.6g化學(xué)純亞鐵氰化鉀于100ml水中（3）0.2 %蒽銅試劑：溶解蒽銅0.2g于100ml95%硫酸中，置棕色瓶中冷暗處 保存（4）0.1 %葡萄糖液：準(zhǔn)確稱干燥葡萄糖 0.

14、1000g定容100ml3. 操作方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制(2) 100ml容量瓶編號沸水浴加熱6分鐘，取出冷卻一用1cm比色杯-610nm測定吸光度一作出以吸光 度為橫坐標(biāo)，糖液濃度為縱坐標(biāo)的準(zhǔn)曲線(3) 樣品測定稱10g樣品一于100ml熱水加入500ml容量瓶中加硫酸鋅5ml-沸水浴5分鐘 -取出再搖動下加亞鐵氰化鉀 5ml,-冷卻-定容500ml-過濾-吸濾液25ml- 于250ml容量瓶-定容250ml-取稀釋液1ml,于比色管中-加10ml蒽銅試劑- 搖勻水浴加熱6分鐘冷卻比色試驗(yàn)注意1, 樣液必須清澈透明，加熱后不應(yīng)有蛋白質(zhì)沉淀2, 樣品顏色較深時，可用活性炭脫色后再進(jìn)行測定3,

15、此法與所用的硫酸濃度和加熱時間有關(guān)4, 所取糖液濃度在1-2.5mg/100ml之間二.還原糖的測定方法還原糖包括葡萄糖、果糖、麥芽糖，在葡萄糖分子中含有淤青的醛莖，在果糖分 子中含有淤青的酮莖，在乳糖中和麥芽糖中含有淤青的半縮羧莖，因此都有還原性。在測定還原糖時一般測定總糖 時所有將糖類水解為轉(zhuǎn)化糖再測定的方法都可用來測定還原糖。（一）斐林氏容量法1. 此法的原理、試劑、方法與總糖的測定方法相同。只是樣品溶液不必以過轉(zhuǎn)化， 而是直接取濾液進(jìn)行滴定，濾液進(jìn)行滴定，濾液中的還原糖含量以在0.2-0.5%為好，又能通過增減樣品量或改變稀釋倍數(shù)來調(diào)節(jié)。10毫升費(fèi)林氏A、B液混合時理論上相當(dāng)還原糖量如

16、下：葡萄糖（無水）果糖或轉(zhuǎn)化糖尿病0.0500克乳糖尿病0.0678克麥芽糖0.0807克 2試劑（1）斐林氏A液，稱69.8g cp硫酸銅于100ml水中，過濾備用（2）斐林氏B液，稱34.6g.cp濃流鋅鈉和100gcp NaOH于1000ml水中，過濾備用3方法稱取樣品10-20g :制備與轉(zhuǎn)化同鐵氰化鉀法。將樣液倒入滴管中，吸取A,B液準(zhǔn)備預(yù)滴定預(yù)滴定：吸A、B液各5ml-從滴管中加15ml樣液一加熱至沸一繼續(xù)滴加樣液一至蘭色變 潛一加3滴次甲基蘭一在1分鐘內(nèi)滴定到終點(diǎn)達(dá)到終點(diǎn)時，稍微過量的轉(zhuǎn)化糖，將蘭色的次甲基蘭染色體還原為無色的隱色體， 而顯出氧化亞銅的紅色，去堿性條件下加熱糖的產(chǎn)

17、物是復(fù)雜的。去堿性中斷裂是由于堿度不同，加熱時間不同，生產(chǎn)不等的碎片，這種碎片給后 面滴定帶來誤差，而且，這種碎片與糖沒有化合量的關(guān)系，所以，Lanecrol-Eynon Method作出數(shù)據(jù)檢索表正式滴定：吸A,B液各5ml-于三角瓶一加比預(yù)定量少 0.5-1.0ml樣液一 2分鐘內(nèi)要求沸騰 1分鐘一加3滴指示劑一用樣液滴定蘭色消失總沸騰時間為3分鐘，即滴定在3分鐘完成。計(jì)算：還原糖=(F V)/(W V) X 100F:轉(zhuǎn)還糖回數(shù)，即與10ml斐林氏試液相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化糖毫克數(shù)，樣品試液總體積樣品試液滴定量W樣品重量在測量乳糖制品時，若蔗糖與乳糖的含量比超過3: 1時，則應(yīng)與滴定量中加上相關(guān)表中

18、(課本中表9-8 )校正值后在進(jìn)行計(jì)算我們舉例如下：如果標(biāo)準(zhǔn)果糖溶液度為每100ml溶液含糖262.5mg。對于10ml斐林試液從9-5 可以查得果糖液滴定應(yīng)為20ml。如果不是20ml，可先算出A,B液校正等數(shù)。然 后進(jìn)行計(jì)算再如標(biāo)準(zhǔn)糖溶液濃度為每100ml溶液含糖199.3ml，對于10ml A,B液 從9-4中查到，糖液滴定量應(yīng)為25.00ml，若有出入可校正。如果要求不高，可省略校正 步驟但要求1%得 測定誤差，則省略校正。另外有時候并未根據(jù)檢索表計(jì)算樣 含糖量，但對A,B液進(jìn)行標(biāo)定，以使確定相當(dāng)?shù)?還原糖量。這種誤差為0.5 %。 下面我們講標(biāo)定量A,B液準(zhǔn)確準(zhǔn)確稱取烘干冷卻得 A.

19、R蔗糖1.5g -用水溶解稱取250ml容量瓶中一定容 吸50ml于100ml定量瓶中加 HCL5m-再65-70攝氏度水裕15分鐘冷卻 一用30% NaOF中和一定容準(zhǔn)確吸A,B液各5ml于三角瓶中一加水約50ml玻璃珠三粒一加熱至沸一保持1 分鐘一加指示劑1滴一再煮1分鐘一立即用糖液滴定至蘭色褪去，紅色出現(xiàn)即為 終占乙八、正式滴定，先加入比預(yù)滴定時少0.5ml左右得糖液煮沸1分鐘加指示劑1滴 再煮沸1分鐘繼續(xù)滴至終點(diǎn)計(jì)算：A = W*V/500X 0.95A:相當(dāng)于10ml斐林氏A B液的轉(zhuǎn)化糖的量W稱取蔗糖的質(zhì)量V :滴定蔗糖的量500:稀釋比0.95 :換算等數(shù)最后計(jì)算：總糖(還原糖)

20、以轉(zhuǎn)化糖計(jì) =( A*1000/W*V) *100A:同上W制取樣品的量V:滴定是時樣品消耗量1000:是稀釋倍數(shù)（100/50*500 ）1. 預(yù)測定的目的：對樣品溶液中還原糖濃度有一定要要求（0.1%左右），測定時樣品溶液的消耗體積應(yīng)該與標(biāo)定葡萄糖標(biāo)液的消耗體積相近，通過測定了解樣品濃度是否合適，濃度過大或過小應(yīng)該加以調(diào)整，使測定時消耗樣品溶液量在10毫升左右；二是通過測定可知道此溶液的大概消耗量，以便在正式的滴定時，預(yù)先加入比實(shí)際用量少1毫升左右的樣液，只留下1ml左右的樣液在續(xù)滴定時加入， 以便保證在1分鐘內(nèi)完成續(xù)滴定工作，提交預(yù)測定的準(zhǔn)確度。2. 此實(shí)驗(yàn)影響測定結(jié)果的主要操作因素是反

21、應(yīng)液堿度、熱源強(qiáng)度，煮沸時間和滴定速度一般煮沸時間短消耗糖多，反之，消耗糖液少，滴定速度過快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。另外溶液堿度愈高，二價銅的還原愈快，因此必須嚴(yán)格 控制反應(yīng)的體積，使反應(yīng)體系堿度一致。熱源一般采用800W電爐，反應(yīng)液在2秒內(nèi)沸騰。（二） KMNO（高錳酸鉀法）1 原理，還原糖在堿性溶液中使銅鹽還原成氧化亞銅，在酸性條件下，氧化亞 銅能使硫酸鐵還原為硫酸亞鐵，再用KMNO溶液滴定硫酸亞鐵，即可標(biāo)出還原糖 的量。2. 操作方法（1）樣品處理a. 乳糖：包括乳制品以及含蛋白質(zhì)的冷食類稱樣2-5g （液體樣2550ml）于250ml容量瓶加水50ml加A液10ml+1NNaO

22、H 4ml 定容靜置30秒過濾棄去初液可測還原糖及蔗糖用。b. 低酒度飲料：麥精露、各類汽酒等飲料。先暴氣除CO取100ml于蒸發(fā)皿中用1 N NaOH中和沸水浴蒸至原體積四 分之轉(zhuǎn)入250ml容量瓶加50ml水搖勻（加A液10ml加1 NNaOHIml） 加水至刻度靜置30秒過濾。c. 含多量淀粉的食品：嬰兒食品、糕干粉、寶寶樂、代乳粉、餅干、面包、糕點(diǎn)等稱樣10-20g250ml容量瓶加水200ml45度水浴加熱1小時不停搖動 冷后加水至刻度靜置吸出清夜 200ml于另一容量瓶（250ml）加A液 10ml+1N NaOH 4m靜置 30 秒過濾。d. 汽水、果露、國產(chǎn)七種可樂及可口可樂處

23、理CO吸樣液100ml于250ml容量瓶加水至刻度可測還原糖及蔗糖。（2）測定方法取50ml處理的樣液于400ml燒杯加 A B液各25ml加熱在4min左右沸騰 再煮2min趁熱抽濾用60C水洗燒杯和沉淀直到洗液不成堿性將抽濾 的紙（或者石棉）及CibC轉(zhuǎn)入原來燒杯用25ml硫酸鐵溶液沖洗抽濾瓶使 沖洗液全部洗入原燒杯中加水 25ml使CuO溶解用0.1N KMnO標(biāo)液滴定至 微紅色，同時用50ml水按上述方法做空白實(shí)驗(yàn)。（3）計(jì)算3. 注意事項(xiàng):（1）煮沸后的溶液顯紅色不顯蘭色，則表示糖量高，可減少取樣體積。（2）在洗滌CsO的整個過程中應(yīng)使沉淀上層保持一層水層，以隔絕空氣，避 免CuO被

24、空氣中的氧所氧化。（3）此法適用于各類食品中還原糖的測定，有色樣液不受限制，準(zhǔn)確度高，重 現(xiàn)性好。準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性都優(yōu)于直接滴定法，但操作復(fù)雜、費(fèi)時，需使用特制的 高錳酸鉀法糖類檢索表。（二）直接滴定法（斐林氏溶液法）1.原理樣品經(jīng)過處理除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)后，加入鹽酸，在加熱條件下使蔗糖水解為還原 性單糖，用直接滴定法測定水解后樣品中的還原糖總量。2試劑3. 方法（1） 取過量樣品進(jìn)行提取，放入250ml容量瓶，加5ml醋酸鋅和5ML亞鐵氰 化鋅，定容，靜止30分后過濾，濾液備用。（2）測定樣品預(yù)滴定：取A、B液各5ml于三角瓶中加水10ml，玻璃珠數(shù)粒，加熱在2分內(nèi)沸騰，趁熱 滴定，滴定到蘭色褪去，記錄用量。正式滴定:取A、B液各5mL于三角瓶一加玻璃珠三粒一從滴定管直接加比預(yù)滴定時少0.5-1.0ML樣液，在2分沸騰，趁熱滴定蘭色褪去，記錄，取三次平均值計(jì)算結(jié)果。三蔗糖的測定1 原理：樣品