在線凝膠滲透色譜―氣相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測煙葉中的農(nóng)藥殘留

1、在線凝膠滲透色譜氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測煙葉中的農(nóng)藥殘留1 引言 為了防治病蟲害，煙草在育種、種植、調(diào)制和保存期間要使 用農(nóng)藥。殘留農(nóng)藥會降低煙葉質(zhì)量，加劇環(huán)境污染， 并威脅人 類和其它生物的健康 1 。因此，煙葉中的農(nóng)藥殘留檢測對保證 煙葉質(zhì)量和環(huán)境安全具有重要意義。 由于煙葉樣品基質(zhì)復(fù)雜， 其 中殘留農(nóng)藥含量低(低至 ng/g 級)，因此通常需要樣品預(yù)處理 過程才能進行后續(xù)測定 2 。目前，液-液萃取3 、固相萃取 4 、 固相微萃取 5 等方法已用于煙葉中農(nóng)藥殘留測定。這些方法存 在有機溶劑消耗量大、操作繁冗費時、回收率低等不足。 Anastassiades 等 6 開發(fā)了“快速、簡便、

2、經(jīng)濟、高效、耐用 且安全(Quick , easy , cheap , effective , rugged and safe , QuEChEF) ”的樣品前處理技術(shù)。 QuEChER方法具有回收率高、 穩(wěn)定性強和被分析目標(biāo)物范圍廣等優(yōu)點， 因此在農(nóng)藥殘留檢測中 廣泛應(yīng)用。常規(guī)QuEChER方法在凈化步驟中通過離心或過濾 將吸附劑與樣品液分離，耗時費力。為了克服這一缺陷，本研究 組以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基鍵合硅烷/四氯化三鐵(GCB/PSA/Fe3O4復(fù)合材料為吸附劑，改進了 QuEChER方法7 ，吸附劑可以在磁場作用下與提取液快速分離，具有操作簡 單、快速高效的優(yōu)點。在線凝膠滲透色

3、譜-氣相色譜-質(zhì)譜（GPC-GC-M）是將凝膠滲透色譜和氣相色譜 -質(zhì)譜在線聯(lián)用的分析檢測技術(shù)，不但具有 抗基質(zhì)干擾能力強、靈敏度高的優(yōu)點，而且可以連續(xù)自動分析， 能提高分析速度和結(jié)果的準確性，已被應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測8 10。本研究采用改進 QuEChER方法對煙葉樣品前處理，以在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GPC-GC-MS/M）檢測，選取 煙草種植生產(chǎn)中對煙葉質(zhì)量和煙草制品產(chǎn)品安全有影響的常用 10種除草劑、抑芽劑和殺蟲劑為代表性化合物，建立了煙葉中 農(nóng)藥殘留量的快速、準確、靈敏分析方法。2 實驗部分2.1 儀器與試劑在線GPC-GC-MS/M系統(tǒng)（日本島津公司）,GPC配有LC-

4、20AD 泵，SIL-20A自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，DGU-20A3R兌氣機 和SPD-20A紫外檢測器；GC-MS/MS包括日本島津2010-plus氣 相色譜和TQ8030三重四級桿質(zhì)譜，由FCV-12AH電磁閥實現(xiàn)GPC 和GC-MS/MS勺在線連接。用Quanta 200掃描電鏡（Quanta 200, FEI， Holland ）對材料形貌進行表征。環(huán)己烷和丙酮（色譜純，韓國德山純化工XX公司）。所用水由Milli-Q 系統(tǒng)（Milford , MA, USA）制得。10種目標(biāo)物 和內(nèi)標(biāo)（磷酸三苯酯）均購自德國 Dr. Ehrenstorfer 公司，以 甲苯（必要時添加

5、丙酮或甲醇）為溶劑配制目標(biāo)物母液（ 100 卩g/mL）?；旌蠘?biāo)準工作溶液（內(nèi)標(biāo)濃度為20 ng/mL ）以甲苯配制，并在-20C下避光保存。采用溶劑熱方法制備Fe3O47:在200 mL反應(yīng)釜內(nèi)將5.0 g FeCI3?6H2O 溶解在100 mL乙二醇 中并攪拌得到澄清溶液，再加入15.0 g NaAc和50 mL乙二胺，攪拌30 min，將反應(yīng)釜于200C下反應(yīng)8 h。待反應(yīng)釜降溫后， 用水和乙醇清洗產(chǎn)物，60 C下干燥，備用。制備磁性吸附劑時，將0.4 g GCB、0.5 g PSA 和1 g Fe3O4置于15 mL具蓋玻璃瓶 內(nèi)，用5 mL乙腈清洗3次后，將產(chǎn)物在60C下干燥即可。

6、2.2 儀器條件GPC條件：色譜柱為 Shodex CLNpakEV-200 (150 mmx 2 mm 16卩m ;柱溫為40C;流動相為環(huán)己烷-丙酮(70 : 30, V/V ); 流速0.1 mL/min ;進樣量10卩L; GPC攵集時間為3.305.30 min; GC-MS/MS件：惰性前置柱 5 m X 0.53 mm 空柱；預(yù)柱 DB-35 ms (5 m X 0.25 mm X 0.25 卩 m)，分離柱 DB-35 ms (25 mX 0.25 mmX 0.25卩n)，柱溫箱程序：初始溫度 82C, 保持5.0 min，再以8C/min升至300C，保持7.75 min ;

7、不分 流進樣，進樣時間7.0 min；高純He為載氣，壓力程序：由120 kPa 開始，以 100 kPa/min 升至 180 kPa，保持 4.4 min，再以 49.8 kPa/min 恢復(fù)至原始壓力，保持 33.8 min ;程序升溫進樣 口程序：120C保持 5 min,以 100C/min 升至 250C，保持 33.7 min;接口和離子源溫度為 300C和200C ；電離源為EI源；電 離電壓70 eV；溶劑延遲時間15 min；目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān) 測(MRM參數(shù)如表1所示，碰撞氣為 Ar，壓力200 kPa。2.3 樣品制備 本研究建立煙葉提取液快速凈化和檢測的方法， 因

8、此直接采 用文獻 2報道的方法提取煙葉：稱取2.00 g煙葉于離心管中，加入 10 mL 水浸潤樣品；靜置 10 min 后加入 10 mL 乙腈 和100卩L內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩2 min ；于-20C下保持10 min后加 入5 mL甲苯、4 g無水Na2SO4 1 g NaCI ，1 g檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉，振蕩 2 min 后離心 5 min ，收集上層提取 液；提取液的凈化和檢測方法為：取 0.5 mL 提取液到裝有磁性 吸附劑的離心管中，振蕩 1 min ；在磁場下將磁性吸附劑與溶液 分離，所得溶液為待測液，可進行在線GPC-GC-MS/M分析。將不含目標(biāo)物的凈化液濃縮吹干

9、， 再加入相同體積、 不同濃度的系 列標(biāo)準工作溶液， 混勻溶解即得到基質(zhì)匹配標(biāo)準曲線。3結(jié)果與討論3.1 磁性吸附劑的表征如圖1a所示，PSA表面光滑，而磁性吸附劑中 PSA表面粗 糙（圖1b）,且在PSA顆粒之間也有材料均勻分布，觀察是 GCB 和Fe3O4顆粒（圖1c）。Fe3O4能使吸附劑在磁場作用下與樣品 溶液快速分離，同時PSA和GCB能分離提取液中的雜質(zhì)。3.2 GPC收集時間考察圖2為在線GPC-GC-MS/M系統(tǒng)的示意圖。其原理為：樣品 經(jīng)GPC柱分離，廢液直接排出系統(tǒng)，含有目標(biāo)物的餾分先被儲存 在定量環(huán)（0.2 mL ）中，再全部注入 GC注入GC的樣品通過打開溶劑蒸氣出口實

10、現(xiàn)溶劑的排出， 同時目標(biāo)分析物在保留在預(yù)柱 中。待溶劑排出口關(guān)閉后柱，溫箱開始升溫，目標(biāo)物進入分析柱 分離。因此選擇收集時間顯得尤為重要。 目標(biāo)物的分子量在溴氰 菊酯和滅螨蜢之間，因此目標(biāo)物在GPCh的保留時間也介于二者 之間，二者在 GPC上的保留時間為3.50和5.08 min?？紤]靈敏 度和基質(zhì)去除效果，確定收集時間為3.305.30 min。3.3改進QuEChER方法的優(yōu)化為了得到較好的凈化效果， 優(yōu)化了磁性吸附劑的用量和凈化 時間（GCB PSA和Fe3O4之間的質(zhì)量比為 4 ： 5 : 10）。如圖3a 所示，隨著吸附劑用量增加， 提取液的顏色由黃色逐漸變?yōu)榻鼰o 色，當(dāng)吸附劑用量

11、達到80 mg時，繼續(xù)增加用量對凈化效果改善 不大。且在考察的范圍內(nèi)，各目標(biāo)物的峰面積沒有變化，這可能 是因為在煙葉提取液中含有甲苯， 使吸附劑與含苯環(huán)目標(biāo)物之間 的相互作用力減弱而引起的。 考慮凈化效果和吸附劑用量， 將吸 附劑的用量定為80 mg。在0.56.0 min范圍內(nèi)，凈化時間對 凈化效果影響不大， 且目標(biāo)物的峰面積沒有變化，這是因為吸附劑在凈化時是分散的， 可以使吸附快速達到平衡，因此凈化時間對凈化效果沒有太大影響。為了穩(wěn)定凈化效果，凈化時間選取1.0 min 。比較了本方法與常規(guī) QuEChER方法的凈化效果，如圖3b所 示，未經(jīng)凈化的煙葉提取液顏色為黃色，經(jīng)過常規(guī) QuECh

12、ER方 法凈化后，提取液顏色變淺；經(jīng)過本方法凈化后，提取液幾乎無色（山）。因此，本方法對色素等雜質(zhì)的去除效果較好。3.4 方法確認 在優(yōu)化條件下，考察了方法的檢出限、定量限、線性范圍和 重現(xiàn)性。檢出限和定量限為目標(biāo)物信噪比為 3和 10時對應(yīng)的濃 度。以目標(biāo)物濃度及其與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫、縱坐標(biāo)，繪制工 作曲線。如表2所示，10種目標(biāo)物的檢出限在 0.94100 ng/L 之間，定量限在3.134 ng/L之間，線性相關(guān)系數(shù) R20.9989。 本方法提取煙葉的結(jié)果與標(biāo)準方法 11 相同，其中 9種目標(biāo)物 （甲氰菊酯除外）的檢出限為 40600 ng/L 。本方法能顯著提 高靈敏度，是由吸附劑

13、降低基質(zhì)干擾和在線GPC-GC-MS/M提高進樣量引起的。為了考察本方法的重現(xiàn)性， 配制 3種濃度（各目標(biāo)物線性范 圍最低值的 2、10和 100倍）的樣品，以一天內(nèi)配制的 4個樣品 和連續(xù) 3 天配制的樣品進行分析，計算日內(nèi)和日間相對標(biāo)準偏 差。如表 3 所示，目標(biāo)物的日內(nèi)及日間精密度分別小于15.1%和19.8%，其中目標(biāo)物在中濃度和高濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù) 值不高于 8.5%，低濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù)值相對較高， 這可能是由于測定誤差引起的。美國分析化學(xué)家學(xué)會（Association of Official Analytical Chemists, AOAQ 提出 12 ，可接受

14、的精密度數(shù)值隨著分析物的濃度或含量降低而升 高。本研究中目標(biāo)物在低濃度（1.524.00卩g/L ）下的精密度 數(shù)值低于21% （目標(biāo)物濃度為10卩g/L時所能接受的精密度數(shù) 值），說明本方法的重現(xiàn)性可以接受。3.5 實際樣品分析為了證明本方法在實際樣品中應(yīng)用的效果， 采用本方法和現(xiàn) 行標(biāo)準方法 11 處理 3 種煙葉樣品并進行測定。 在樣品 A 中測到 了七氟菊酯、 二甲戊靈和聯(lián)苯菊酯， 采用本方法和標(biāo)準方法均無 法對其進行定量分析； 在樣品 B 中測到了七氟菊酯， 兩種方法的 測定結(jié)果為1.06和1.03卩g/L ,對氟節(jié)胺和聯(lián)苯菊酯均無法進 行定量分析；在樣品C中測到了仲丁靈、二甲戊靈和

15、氟節(jié)胺，兩 種方法的測定結(jié)果為 92.1和92.7卩g/L、108.2和112.2卩g/L 以及3.68和3.70卩g/L ,對七氟菊酯也均無法進行定量分析。 結(jié)果表明，本方法與標(biāo)準方法11的檢測結(jié)果相吻合。樣品C中 測到的目標(biāo)物數(shù)目最多，給出了其中被測到目標(biāo)物的典型色譜 圖。如圖 4 所示，目標(biāo)物均不存在干擾。同時，對凈化前的煙葉 提取液直接進行在線GPC-GC-MS/M分析，檢測結(jié)果與以上兩種 方法不存在顯著性差異：在樣品B中測到了七氟菊酯，其濃度為 1.01卩g/L ；在樣品C中測到了仲丁靈、二甲戊靈和氟節(jié)胺，其 濃度為 92.8 , 110.2 和 3.81 卩 g/L。將上述 3 種

16、樣品加標(biāo)后用本方法測定， 將所測量與實際加標(biāo) 量相比得到相對回收率。如表 4 所示，目標(biāo)物的相對回收率在 68.8%132.2%之間，不同實際樣品中目標(biāo)物在不同濃度下的回 收率相差較大，可能是因為不同產(chǎn)地?zé)熑~樣品的基質(zhì)差異引起 的。使用氣相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜檢測煙葉中的農(nóng)藥殘留時，基質(zhì)增強效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)同時都存在 13 ，其中含有氨基的極性農(nóng) 藥化合物在氣相色譜分析時主要表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng) （如二甲戊 靈和聯(lián)苯菊酯，回收率最高為 132.2%），但含有同一功能基團 的化合物由于理化特性的差異所呈現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)也會有較大差 別（如七氟菊酯，回收率最低為68.8%），而且同一化合物在不同濃度水平和

17、樣品基質(zhì)下產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)程度也不盡相同 （如甲 氰菊酯） 14 。4 結(jié) 論采用磁性吸附劑凈化煙葉提取液，再用在線 GPC-GC-MS/MS 檢測，優(yōu)化了在線 GPC-GC-MS/M條件和影響凈化效果的因素， 在最佳的條件下建立了煙葉樣品中 10 種農(nóng)藥殘留量的測定新方 法，并用于實際煙葉樣品的測定。 由于磁性吸附劑可以在磁場作 用下實現(xiàn)快速回收，且在線GPC-GC-MS/M系統(tǒng)可以提高進樣量。 與現(xiàn)有標(biāo)準方法 11 相比，本方法具有樣品前處理過程操作簡 單、凈化能力強、靈敏度高等優(yōu)點，為日常煙葉樣品中農(nóng)藥殘留 量的測定提供了一種可選擇的方法。References1 Damalas C A，

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