體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)

1、十、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test1 范圍 本規(guī)范規(guī)定了體外哺乳類細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法。 本規(guī)范適用于檢測(cè)化妝品原料及其產(chǎn)品的致突變性。2 規(guī)范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 476, 1997)3 試驗(yàn)?zāi)康?該測(cè)試系統(tǒng)用于檢測(cè)化妝品原料及其產(chǎn)品引起的突變，包括堿基對(duì)突變、移碼突變和缺 失等，從而評(píng)價(jià)受試物引起突變的可能性。4 定義正向突變( Forward mutation )：從原型至突變子型的基因突變，這種突變可引起酶

2、和功能 蛋白的改變。突變頻率( Mutant frequency )：所觀察到的突變細(xì)胞數(shù)與存活細(xì)胞數(shù)之比值。5 試驗(yàn)原理 在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使細(xì)胞暴露于受試物一定時(shí)間，然后將細(xì)胞再 傳代培養(yǎng)，突變細(xì)胞在含有 6-硫代鳥嘌呤( 6-thioguanine ，6-TG )或三氟胸苷( trifluorothymidine ， TFT )的選擇性培養(yǎng)液中能繼續(xù)分裂并形成集落?；谕蛔兗鋽?shù)，計(jì)算突變頻率以評(píng)價(jià)受試 物的致突變性。6 試驗(yàn)方法6.1 試劑和受試物制備6.1.1 受試物6.1.1.1 受試物的配制：固體受試物需溶解或懸浮于溶劑中，用前稀釋至適合濃度；液體受試 物可以直

3、接加入試驗(yàn)系統(tǒng) /或用前稀釋至適合濃度。受試物應(yīng)在使用前新鮮配制，否則就必須 證實(shí)儲(chǔ)存不影響其穩(wěn)定性。6.1.1.2 溶劑的選擇：溶劑必須是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細(xì)胞存活和S9 活性。首選溶劑是水或水溶性溶劑。二甲基亞砜(DMSO )也是常用溶劑，但使用時(shí)濃度不應(yīng)大于 0.5%。6.1.1.3 受試物濃度設(shè)置6.1.1.3.1 最高濃度的選擇：決定最高濃度的因素是細(xì)胞毒性、受試物在試驗(yàn)系統(tǒng)中的溶解度 以及 pH 或滲克分子濃度( osmolality )的改變。6.1.1.3.2 細(xì)胞毒性的確定：應(yīng)使用指示細(xì)胞完整性和生長(zhǎng)情況的指標(biāo)，在活化系統(tǒng)存在或不 存在兩種條件下確定細(xì)

4、胞毒性，例如相對(duì)集落形成率或相對(duì)細(xì)胞總生長(zhǎng)情況(total growth )。應(yīng)在預(yù)試驗(yàn)中確定細(xì)胞毒性和溶解度。6.1.1.3.3 劑量設(shè)置至少應(yīng)設(shè)置 4個(gè)可供分析的濃度。當(dāng)有細(xì)胞毒性時(shí)，其濃度范圍應(yīng)包括從最大毒性至幾乎無毒性。通常濃度間隔系數(shù)不大于10。如最高濃度是基于細(xì)胞毒性，那么該濃度組的細(xì)胞相對(duì)存活率（相對(duì)集落形成率）或相對(duì)細(xì)胞總生長(zhǎng)情況應(yīng)為10%20% （不低于10% ）。對(duì)于那些細(xì)胞毒性很低的化合物，最高濃度應(yīng)是5止/mL, 5mg/mL或O.OImol/L。對(duì)于相對(duì)不溶解的物質(zhì)，其最高濃度應(yīng)達(dá)到或超過在細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下的溶解度限值。最好在試驗(yàn)處理開始和結(jié)束時(shí)均評(píng)價(jià)溶解度，因?yàn)橛捎赟

5、9等的存在，試驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)在暴露過程中溶解度可能發(fā)生變化。不溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不應(yīng)影響觀察。6.1.2 對(duì)照：在每一項(xiàng)試驗(yàn)中，在代謝活化系統(tǒng)存在和不存在的條件下均應(yīng)設(shè)陽性對(duì)照和陰 性（溶劑）對(duì)照。6.1.2.1陽性對(duì)照：當(dāng)使用代謝活化系統(tǒng)時(shí)，陽性對(duì)照物必須是要求代謝活化、并能引起突變 的物質(zhì)。在沒有代謝活化系統(tǒng)時(shí)，陽性對(duì)照物可使用甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate-EMS ）、甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate, MMS ）,乙基亞硝基脲（ethyl nitrosourea-ENU ）等。 在有代謝 活化系 統(tǒng)時(shí)，可 以使用3-甲基膽蒽（3-

6、methylchola nthre ne ）、環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide） N-亞硝基胍（N-nitroso-dimethylamine ）、7,12-二甲基苯蒽等。也可使用 其他適宜的陽性對(duì)照物。6.1.2.2 陰性對(duì)照物：陰性對(duì)照（包括溶劑對(duì)照）除不含受試物外，其他處理應(yīng)與受試物相同。 此外，當(dāng)不具有實(shí)驗(yàn)室歷史資料證實(shí)所用溶劑無致突變作用和無其他有害作用時(shí)，還應(yīng)設(shè)空白對(duì)照。6.1.3 細(xì)胞：HPRT位點(diǎn)突變分析常用中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞株（V-79 ）和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株（CHO）。TK位點(diǎn)突變分析常用小鼠淋巴瘤細(xì)胞株（L5178Y ）和人類淋巴母細(xì)胞株（TK6 ）。6.1.4 培

7、養(yǎng)液：應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)所用系統(tǒng)和細(xì)胞類型來選擇適宜的培養(yǎng)基。對(duì)于V-79或CHO細(xì)胞，常用MEM （Eagle）培養(yǎng)基加入10%胎牛血清和適量抗菌素。對(duì)于 L5178Y或TK6細(xì)胞， 常用RPMI 1640培養(yǎng)基加入10%馬血清和適量抗菌素。6.1.5活化系統(tǒng)：同體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)。6.1.6 選擇劑：6-硫代鳥嘌呤（6-TG ）:建議使用終濃度為 5mg/mL。三氟胸苷（TFT）:建議 使用終濃度為3mg/mL。6.2 試驗(yàn)步驟6.2.1 HPRT位點(diǎn)突變分析6.2.1.1試驗(yàn)前1d,接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，置于37C孵箱培養(yǎng)。6.2.1.2 試驗(yàn)時(shí)吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試物

8、、S9-mix （不加入S9-mix的樣品，用培養(yǎng)液補(bǔ)足）及一定量的不含血清培養(yǎng)液，置孵箱中處理3h6h后，吸去培養(yǎng)液，用Hank液洗細(xì)胞三次，加入含胎牛血清的培養(yǎng)液。6.2.1.3在受試物與細(xì)胞作用后當(dāng)天和第 3d將細(xì)胞按低密度分種，在第7d接種細(xì)胞，每個(gè)劑 量3瓶。7d后染色以測(cè)定細(xì)胞存活率。另將一定數(shù)量細(xì)胞接種于每個(gè)培養(yǎng)瓶中，每個(gè)劑量8瓶，3h后加入6-TG （終濃度為5mg/mL ）, 10d后染色，計(jì)數(shù)突變細(xì)胞集落。26.2.1.4試驗(yàn)結(jié)果用x檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。6.2.2 TK位點(diǎn)突變分析（L5178Y細(xì)胞，96孔板法）6.2.2.1 處理：取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，調(diào)整密度為5X105/m

9、L，按 1%體積加入受試物，37C震搖處理3小時(shí)。離心，棄上清液，用PBS或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2遍，重新懸浮細(xì)胞于8個(gè)細(xì)胞/mL，接含10%馬血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，并調(diào)整細(xì)胞密度為2X105/mL。6.2.2.2 PE0 （0天的平板接種效率）測(cè)定：取適量細(xì)胞懸液，作梯度稀釋至種96孔板（每孔加0.2 mL,即平均1.6個(gè)細(xì)胞/孔），每個(gè)劑量作12塊板，37C, 5% CO2, 飽和濕度條件下培養(yǎng) 12d，計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。6.223表達(dá)：步驟 6.2.2.1所得細(xì)胞懸液作 2d表達(dá)培養(yǎng)，每天計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在610 /ml以下。6.2.2.4 PE2 （第

10、2d的平板接種效率）測(cè)定：第2d表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細(xì)胞懸液，按步驟6.2.2.2作梯度稀釋并接種 96孔板，培養(yǎng)12d后計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。6.2.2.5 TFT抗性突變頻率（MF ）測(cè)定：第2d表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞 密度為1X104/mL，加入TFT （三氟胸苷，終濃度為 3/mL）,混勻，接種96孔板（每孔加 0.2 mL,即平均2000個(gè)細(xì)胞/孔），每個(gè)劑量作24塊板，37C, 5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng) 12d,計(jì)數(shù)有突變集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。6.2.2.6計(jì)算6.2.2.6.1平板效率（PE0和PE2）匚 匚-ln (EW/TW )式中：EW為無集落

11、生長(zhǎng)的孔數(shù)；TW為總孔數(shù);PE =1.61.6為每孔接種細(xì)胞數(shù)6.2.2.6.2相對(duì)存活率（%RS）相對(duì)存活率（%RS） = PE0 （處理）X100PEo (對(duì)照)6.2.2.6.3 突變頻率(MF )-6MF(X10 )=-In （ EW/TW ） /n 式中：EW為無集落生長(zhǎng)的孔數(shù)；TW為總孔數(shù);PEn為每孔接種細(xì)胞數(shù)（2000）7 結(jié)果評(píng)價(jià)在下列兩種情況下可判定受試物在本試驗(yàn)系統(tǒng)中為陽性結(jié)果：（1）受試物引起突變頻率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、并與劑量相關(guān)的增加。（2）受試物在任何一個(gè)劑量條件下，引起具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有可重復(fù)性的陽性反應(yīng)。陰性結(jié)果的判定需在 RS達(dá)土 20% （即已產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒

12、性）的情況下未見突變頻率顯 著增加時(shí)方可作出。在評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)把生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)合考慮。陽性結(jié)果表明受試物可引起所用哺乳類細(xì)胞的基因突變?？芍貜?fù)的陽性劑量一反應(yīng)關(guān)系 意義更大。陰性結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件下，受試物不引起所用哺乳類細(xì)胞的基因突變。8試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容： 受試物名稱、有關(guān)的理化性狀、所用溶劑及其配制、齊U量選擇（應(yīng)說明受試物對(duì)細(xì)胞 毒性的測(cè)定方法、溶解情況等）；（2）細(xì)胞株名稱；（3）實(shí)驗(yàn)條件和方法 代謝活化系統(tǒng)：制備 S9時(shí)所用的誘導(dǎo)劑、動(dòng)物品種和來源、S9 mix的配方; 對(duì)照物：陽性對(duì)照物名稱和使用濃度；陰性（溶劑）對(duì)照物名稱及使用濃度； 培養(yǎng)液：所用培養(yǎng)液名稱、血清類別和使用濃度； 接種時(shí)的細(xì)胞密度以及所