(項(xiàng)目管理)項(xiàng)目名稱重要親源分子對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控首席科學(xué)家

1、項(xiàng)目名稱：重要親源分子對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控首席科學(xué)家：孟安明 清華大學(xué)起止年限：2011.1 至 2015.8依托部門：教育部二、預(yù)期目標(biāo)1.總體目標(biāo)人類和脊椎動(dòng)物的生命周期起始于受精卵胚胎的早期發(fā)育， 對(duì)該過(guò)程的深入 了解對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育、 人類健康和醫(yī)學(xué)、 畜禽生產(chǎn)、 物種保護(hù)等都有重要的潛在價(jià) 值。本項(xiàng)目將穩(wěn)定一支高學(xué)術(shù)水平的研究團(tuán)隊(duì)， 充分利用斑馬魚、 爪蛙和哺乳動(dòng) 物細(xì)胞系等研究系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和互補(bǔ)性， 重點(diǎn)研究母源和父源因子， 研究它們?cè)谂?胎卵裂、體軸決定、胚層形成、細(xì)胞分化與遷移等過(guò)程中的作用，深入了解它們 發(fā)揮功能的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， 從而更全面、 系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)

2、育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 在相關(guān)領(lǐng)域取得一些理論、 方法和技術(shù)突破， 促進(jìn)我國(guó)基礎(chǔ) 醫(yī)學(xué)和生殖、代謝、干細(xì)胞相關(guān)疾病等領(lǐng)域的發(fā)展；培養(yǎng)高水平研究人才，形成 能夠持續(xù)進(jìn)行創(chuàng)新性研究的能力；促進(jìn)我國(guó)發(fā)育生物學(xué)學(xué)科的發(fā)展。2.五年預(yù)期目標(biāo)在五年的實(shí)施過(guò)程中， 本團(tuán)隊(duì)將圍繞設(shè)定的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題， 從分析胚層的決 定和分化、卵母細(xì)胞及早期卵裂的周期控制以及干細(xì)胞分化潛能的控制等生物學(xué) 現(xiàn)象入手，實(shí)現(xiàn)如下目標(biāo)：1）鑒定一批脊椎動(dòng)物母源因子，明確數(shù)個(gè)因子在早期胚胎胚層誘導(dǎo)和分化 中的作用， 認(rèn)知中囊胚轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)理； 發(fā)現(xiàn)相關(guān)的新的信號(hào)通路或新的信 號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，加深對(duì)早期胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)。2）鑒定一批

3、脊椎動(dòng)物父源特異性 RNA ，有可能突破性地發(fā)現(xiàn)父源 RNA 在 胚胎早期發(fā)育中的普遍作用和特異性作用及其機(jī)理。3）了解已知的幾個(gè)多能性因子在胚層形成和分化中與母源胚層決定信號(hào)之 間的調(diào)控關(guān)系，探索數(shù)個(gè)母源或父源因子在干細(xì)胞多能性和定向分化中的作用。4）建立新的母源和父源因子鑒定和功能研究技術(shù)，完善相應(yīng)當(dāng)研究平臺(tái)。5）發(fā)表高影響因子文章 510 篇；在國(guó)際主流期刊上發(fā)表論文 50 80 篇6）培養(yǎng)可持續(xù)發(fā)展的學(xué)術(shù)梯隊(duì)： 博士后、副研究員 10-12 名；博士生 40-50 名；技術(shù)支持人員 8-10 名三、研究方案總體研究方案1學(xué)術(shù)思想本項(xiàng)目的中心學(xué)術(shù)思想是以斑馬魚和爪蛙為模式生物， 輔以哺乳

4、動(dòng)物胚胎干 細(xì)胞研究系統(tǒng)， 從分子、 細(xì)胞和胚胎整體水平闡述胚胎早期發(fā)育過(guò)程中， 預(yù)存于 卵子和精子中的親源分子在胚層發(fā)育中的功能和調(diào)控機(jī)制， 著力于未知親源分子 的鑒定、發(fā)育功能分析、 基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制分析和對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的新的調(diào)控機(jī) 制的探索。2技術(shù)路線本項(xiàng)目將利用斑馬魚和爪蛙兩種模式動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)， 采用反向遺傳分析和正向 遺傳分析的策略， 鑒定與胚層形成相關(guān)的母源和父源因子， 然后利用已有的基因 表達(dá)、功能和機(jī)制研究技術(shù)手段， 探討這些因子在早期發(fā)育中的功能和作用機(jī)制。在利用正向遺傳學(xué)方法研究斑馬魚母源因子對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化的影響方面， 我們利用 Tol2 轉(zhuǎn)座子插入法捕獲母體基因， 當(dāng)轉(zhuǎn)座

5、子基因組（含 GFP 報(bào)告基因） 插入到一個(gè)母體基因內(nèi)時(shí)， GFP 報(bào)告基因的表達(dá)將受該母體基因啟動(dòng)子的控制， 因而在卵母細(xì)胞中可觀察到 GFP的存在；通過(guò)Tail - PCR、inverted PCR、RACE 等方法，可以比較容易地克隆出該母體基因。如果雜合體之間配種得到的 F2 純 合體能夠長(zhǎng)大到性成熟， 雌性個(gè)體因該母源基因被轉(zhuǎn)座子破壞而不能表達(dá)出有功 能的蛋白，其產(chǎn)出的卵子中就缺乏該母源基因產(chǎn)物， 與野生型或雜合型雄性個(gè)體 的精子受精后的胚胎就可能出現(xiàn)胚層誘導(dǎo)和分化等方面的缺陷， 稱之為母源突變 體。我們獲得母源突變體之后， 將檢測(cè)突變體胚胎中各個(gè)胚層的標(biāo)記基因的表達(dá)、 Wnt 、N

6、odal 、BMP 等關(guān)鍵發(fā)育信號(hào)通路的組份的表達(dá)；在突變體中過(guò)表達(dá)一 些胚層誘導(dǎo)和分化的關(guān)鍵基因如sqt 、beta-catenin 、 bmp2b 、fgf8 、 sox32等,確定它們與突變的母源基因之間的遺傳互作關(guān)系。為了深入闡明有重要功能 的母源因子的作用機(jī)理， 將利用酵母雙雜交、 免疫共沉淀等技術(shù)途徑鑒定其互作 因子，再在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中研究其在相關(guān)信號(hào)通路中的作用， 獲得的結(jié)果再回 到胚胎中進(jìn)行驗(yàn)證。 另一方面， 對(duì)于那些在斑馬魚上發(fā)現(xiàn)的有重要功能的母源基 因，將在爪蛙胚胎上檢驗(yàn)其功能的保守性。在反向遺傳分析方面， 我們將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和卵母細(xì)胞基因下調(diào)技術(shù)鑒定 參與爪蛙胚層形成

7、的母源基因， 利用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù) （比如 deep sequencing ） 鑒定斑馬魚父源特異性 RNA 。然后設(shè)計(jì)特異性的嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸去 抑制相應(yīng)基因的 mRNA （或小 RNA ）的表達(dá)。在爪蛙上，將反義寡核苷酸注射 到收集的卵母細(xì)胞中，可以有效地剔除儲(chǔ)存在卵母細(xì)胞中的目標(biāo)mRNA ，體外培養(yǎng) 2 天后 （可以使原來(lái)已存在的蛋白降解 ），再將卵母細(xì)胞回移到處理過(guò)的雌蛙 輸卵管中，并進(jìn)行自然受精（本項(xiàng)目組成員陶慶華教授實(shí)驗(yàn)室是全世界屈指可數(shù) 熟練掌握該方法的團(tuán)隊(duì)）。在斑馬魚上，我們正在建立類似的技術(shù)。抑制父源特 異性 RNA 相對(duì)比較簡(jiǎn)單（因?yàn)檫M(jìn)入卵子的特定父源 RNA 的量極

8、少），將反義 寡核苷酸注射到單細(xì)胞受精卵中即可。 對(duì)于注射了反義寡核苷酸的胚胎， 將首先 從形態(tài)學(xué)上觀察胚胎的胚層變化， 然后檢測(cè)常用的胚層標(biāo)記基因的表達(dá)， 確認(rèn)其 可能的作用。 在鑒定到對(duì)胚層形成有重要影響的父源或母源基因后， 我們將根據(jù) 其表達(dá)譜、 表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)和突變體表型， 利用體內(nèi)、 體外系統(tǒng)研究其發(fā)揮生物 學(xué)功能的分子機(jī)理?？紤]到 Wnt 和 TGF-beta 信號(hào)，以及細(xì)胞全能性相關(guān)因子 在胚胎早期發(fā)育中起著廣泛而重要的作用， 因此鑒定出對(duì)胚層形成有重要影響的 親源基因后，將重點(diǎn)研究它們與細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞分化調(diào)控因子的相互作用關(guān) 系。另一方面， TGF-beta 和 Wnt 信

9、號(hào)，以及與干細(xì)胞全能性相關(guān)的重要調(diào)控 因子大多數(shù)都在早期胚胎發(fā)育、 特別是胚層形成中發(fā)揮重要作用， 因此我們也計(jì) 劃分析 TGF-beta 和 Wnt 信號(hào)相關(guān)調(diào)控因子以及干細(xì)胞全能性相關(guān)因子（如 Oct4 ， nanog ， Klf4 等）在胚層形成中的功能和作用機(jī)制。在前期工作中， 我們已經(jīng)通過(guò)酵母雙雜交、 染色體免疫沉淀、 基因芯片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多受 Wnt 和 TGF-beta 信號(hào)通路調(diào)節(jié)的基因， 以及與這兩個(gè)信號(hào)通路上的介導(dǎo)因子或調(diào)節(jié) 因子相互結(jié)合的蛋白， 在本項(xiàng)目中將重點(diǎn)研究它們?cè)谂咛ピ缙诎l(fā)育， 特別是胚層 形成中的功能和對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)理。 在研究它們的生物學(xué)功能方面，

10、將 主要開展以下分析： 1 ）利用原位雜交確定它們?cè)谂咛グl(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜； 2 ） 將體外合成的野生型 mRNA 或突變型 mRNA 注射到胚胎中，觀察其對(duì)胚胎圖 式發(fā)育的影響，并檢測(cè)相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)的變化； 3）合成 Morpholino 反義寡 核苷酸，將其注射到胚胎或爪蛙的卵母細(xì)胞中，使相應(yīng)基因功能被減弱或失活， 觀察胚胎發(fā)育異常（檢測(cè)形態(tài)和標(biāo)記基因）； 4）將一個(gè)基因的 mRNA 或反義 寡核苷酸與相關(guān)信號(hào)通路的其它基因的 mRNA 或反義寡核苷酸組合注射，探討 基因互作關(guān)系， 建立相關(guān)發(fā)育途徑的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 在研究新基因?qū)π盘?hào)通路的 調(diào)節(jié)機(jī)理方面，將主要利用體外的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，分

11、析內(nèi)容主要包括： 1 ）該基 因過(guò)表達(dá)或被抑制時(shí)對(duì) Wnt 和 TGF-beta 信號(hào)的影響； 2）過(guò)表達(dá)或被抑制時(shí)對(duì) Wnt 和 TGF-beta 信號(hào)通路中的介導(dǎo)因子或調(diào)節(jié)因子的表達(dá)、修飾或穩(wěn)定性的 影響； 3）亞細(xì)胞定位及其動(dòng)態(tài)變化； 4）功能域的鑒定； 5）獲得的機(jī)理在體內(nèi) 系統(tǒng)中的驗(yàn)證，希望獲得相應(yīng)的遺傳學(xué)證據(jù)。在研究策略上， 我們將充分發(fā)揮這兩種模式生物的特色和技術(shù)優(yōu)勢(shì)， 特別注 意兩種模式動(dòng)物研究系統(tǒng)之間的結(jié)合、 胚胎體內(nèi)研究與培養(yǎng)細(xì)胞體外研究之間的 結(jié)合、以及不同信號(hào)通路之間的交互作用研究， 從而保證研究成果的高質(zhì)量、 高 水平，在分子機(jī)理上認(rèn)識(shí)胚層誘導(dǎo)和分化、母源 - 合子轉(zhuǎn)

12、換等發(fā)育過(guò)程的調(diào)控規(guī) 律。3創(chuàng)新點(diǎn)和特色本項(xiàng)目關(guān)注的生物學(xué)問(wèn)題是胚胎發(fā)育中胚層的誘導(dǎo)和分化， 這是所有動(dòng)物發(fā) 育過(guò)程中的重要階段， 是多細(xì)胞生物形成的最原始和最基礎(chǔ)性的事件。 現(xiàn)有的研 究結(jié)果顯示，胚層的發(fā)育是精卵配子中預(yù)存的親源因子和受精卵合子基因之間互 作的結(jié)果， 其中親源因子起到了決定性的起始和調(diào)控作用。 但關(guān)于親源因子在胚 層形成和分化中的功能研究，受技術(shù)限制，一直是早期胚胎發(fā)育研究中的難點(diǎn)。 本項(xiàng)目選用脊椎動(dòng)物胚層形成研究中最常用的斑馬魚和爪蛙為模式生物， 輔以體 外研究系統(tǒng)，利用分子、細(xì)胞、生化、組學(xué)等多種研究手段，希望能揭示親源因 子在脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育， 特別是胚層誘導(dǎo)和分化

13、中的功能和分子機(jī)制。 因此 本項(xiàng)目完全能夠產(chǎn)生創(chuàng)新性的研究成果。本項(xiàng)目的特色之一是分別從鑒定參與胚層發(fā)育的新基因和從胚層形成相關(guān) 細(xì)胞信號(hào)和細(xì)胞全能性因子入手， 以鑒定新基因和新功能為切入點(diǎn)， 在很大程度 上保證了研究的原創(chuàng)性和新穎性，使整個(gè)研究從一開始就站在了本領(lǐng)域的最前 沿。本項(xiàng)目的特色之二是選擇了合適的研究系統(tǒng)， 即斑馬魚、 爪蛙和體外細(xì)胞系 統(tǒng)。斑馬魚和爪蛙均具有產(chǎn)卵量大、體外受精、胚胎體外發(fā)育的特性，容易觀察 胚胎早期的發(fā)育過(guò)程，也為未受精卵（卵母細(xì)胞）和受精卵中的基因修飾（如 mRNA 的過(guò)量表達(dá)或抑制）提供了基本條件，因而已成為研究脊椎動(dòng)物早期胚 胎發(fā)育的兩個(gè)最常用的模式系統(tǒng)。

14、此外，斑馬魚上容易進(jìn)行轉(zhuǎn)基因、 誘變等遺傳 操作以及細(xì)胞譜系標(biāo)記和跟蹤； 爪蛙胚體大， 較容易進(jìn)行顯微手術(shù)操作； 爪蛙的 卵母細(xì)胞可以較長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)，使剔除母源蛋白和抑制母源 RNA 表達(dá)成為可 能。體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理方面具有不可替代的優(yōu)勢(shì)， 可 用于闡明基因 / 蛋白發(fā)揮作用的分子機(jī)理和網(wǎng)絡(luò)。本項(xiàng)目將這三個(gè)研究系統(tǒng)結(jié)合 起來(lái)，可以充分利用其各自的優(yōu)勢(shì)， 實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)； 又可以在不同系統(tǒng)中互相印 證，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論的可靠性提供保證。本項(xiàng)目的特色之三是，在人員組成上，既各有專攻，有互為補(bǔ)充。本項(xiàng)目是 在原重大研究計(jì)劃項(xiàng)目 “胚胎早期發(fā)育的分子機(jī)理研究” 基礎(chǔ)上的延續(xù)，

15、在該項(xiàng) 目的資助下， 孟安明，陳曄光，張建和吳畏實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立起緊密的合作關(guān)系和 通暢的共享技術(shù)平臺(tái)。 得益于近兩年回國(guó)的陶慶華教授和曹螢教授的加盟， 給這 個(gè)團(tuán)隊(duì)引入了爪蛙母源基因功能分析技術(shù)和干細(xì)胞全能性因子在爪蛙中的功能 研究體系，加上原有的多年從事早期胚胎發(fā)育研究的高水平發(fā)育生物學(xué)家和長(zhǎng)期 從事細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的高水平細(xì)胞生物學(xué)家， 使得這個(gè)團(tuán)隊(duì)可以全方位地開展 胚層形成研究。這幾個(gè)方面的研究人員的協(xié)作將有助于從分子機(jī)理上揭示胚層形 成的規(guī)律， 更有可能取得重大的發(fā)現(xiàn)。 此外，本項(xiàng)目的所有人員都全時(shí)在國(guó)內(nèi)工 作，主要骨干都有獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室， 這樣一個(gè)穩(wěn)定的高水平的研究團(tuán)隊(duì)， 為實(shí)現(xiàn)項(xiàng) 目

16、的預(yù)期目標(biāo)提供了充分的保障。4取得重大突破的可行性分析研究早期胚胎發(fā)育中母源因子對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控機(jī)理是國(guó)際上發(fā)育 生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，但也是難點(diǎn)；而父源 RNA 在胚胎早期發(fā)育中的作用是最近 才認(rèn)識(shí)（推測(cè)）到的，但尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)， 因而是可產(chǎn)生突破性發(fā)現(xiàn)的研究方向。 近幾年來(lái)， 本項(xiàng)目的主要參加人員在胚胎發(fā)育的調(diào)控機(jī)理方面做了大量、 扎實(shí)的 工作，獲得了一批有重要科學(xué)價(jià)值的成果。 在此基礎(chǔ)上， 我們計(jì)劃把研究進(jìn)一步 集中在“親源因子對(duì)胚層形成的調(diào)控” 這個(gè)方向上， 取得重大突破性成果的可能 性是很高的。工作基礎(chǔ)方面， 孟安明，陳曄光，張建、吳畏、趙慶順實(shí)驗(yàn)室完全立足國(guó)內(nèi)， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)參與

17、脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育調(diào)控的新基因， 并詳細(xì)闡述了它們調(diào)控 胚胎發(fā)育的分子機(jī)制和它們與 Wnt 、TGF-beta 等信號(hào)的關(guān)系， 在世界主流雜志 Cell 、Science 、Dev Cell 、Development 、EMBO J 、Blood ，Genome Res ， PNAS ，J Neurosci ，J Cell Sci、J Biol Chem 、Dev Biol 等發(fā)表多篇研究論文， 并有許多合作發(fā)表的高水平論文。 陶慶華和曹螢也已經(jīng)在國(guó)內(nèi)建立了獨(dú)立的實(shí)驗(yàn) 室，全時(shí)在國(guó)內(nèi)工作，已完成了很有希望的基礎(chǔ)性工作（見(jiàn)工作基礎(chǔ)），并與參 與本項(xiàng)目的其它實(shí)驗(yàn)室開始了合作研究。 本項(xiàng)目將這幾個(gè)

18、研究組結(jié)合起來(lái)， 集中 精力，從不同角度共同研究早期胚胎發(fā)育中胚層形成的調(diào)控機(jī)理， 可以實(shí)現(xiàn)不同 研究系統(tǒng)的互補(bǔ)和研究結(jié)果的相互驗(yàn)證， 促進(jìn)各實(shí)驗(yàn)室研究深度的提高， 大大提 高了取得重大突破的可能性。 這樣實(shí)質(zhì)性的合作研究是單個(gè)研究體系、 單個(gè)實(shí)驗(yàn) 室所難以企及的。5. 課題設(shè)置（一）課題設(shè)置的思路為了實(shí)現(xiàn)預(yù)定研究目標(biāo)，我們將圍繞“胚層的形成和分化受母源信號(hào)控制” 這一中心假說(shuō)， 綜合利用多學(xué)科技術(shù)、 多模式系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)， 充分發(fā)揮各研究組的 學(xué)術(shù)專長(zhǎng)， 從多角度、多層面、多視野研究胚層決定和分化過(guò)程中生物大分子之 間、基本細(xì)胞信號(hào)通路之間如何相互作用， 如何控制胚胎細(xì)胞的基本功能， 研究 早期

19、胚胎如何通過(guò)這些分子、 細(xì)胞水平的調(diào)控機(jī)制推動(dòng)個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行。 基 于這樣的思路，同時(shí)考慮項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)成員的研究方向的共性和課題內(nèi)學(xué)術(shù)交流的方 便性，我們?cè)O(shè)置四個(gè)課題。（二）課題設(shè)置課題一、脊椎動(dòng)物親源因子的鑒定及功能研究本課題將從兩方面開展研究：1. 斑馬魚母源分子在胚層誘導(dǎo)和分化中的作用1）關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題脊椎動(dòng)物細(xì)胞的卵子和精子均包含單倍的染色體，在精、卵融合后啟動(dòng)生 物個(gè)體的發(fā)育過(guò)程。 卵子不但比精細(xì)胞個(gè)體大， 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為卵細(xì)胞也儲(chǔ)存了用 于最早期發(fā)育的除精子染色體之外的所有必需因子。 本課題要探討的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn) 題是哪些母源因子在胚層誘導(dǎo)和分化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它們的作用機(jī)理是什 么，它

20、們與已知的關(guān)鍵發(fā)育信號(hào)通路的關(guān)系是什么。（2）研究目標(biāo)鑒定新的斑馬魚母源分子，研究它們?cè)诎唏R魚卵母細(xì)胞周期、胚胎卵裂、 胚層決定和分化中的功能， 在生化水平探討它們的作用機(jī)制， 并研究這些基因與 已知胚胎發(fā)育中關(guān)鍵信號(hào)通路的相互作用關(guān)系。 將新發(fā)現(xiàn)的參與早期發(fā)育其他方 面調(diào)控的基因提供給其他三個(gè)課題組進(jìn)行研究。（3）研究?jī)?nèi)容母源基因突變體的鑒定：在遺傳篩選方面，利用我們已有的 Tol2 轉(zhuǎn)座子基 因插入突變的技術(shù)，篩選斑馬魚母源突變體并鑒定和克隆一批斑馬魚母源基因， 然后通過(guò)轉(zhuǎn)基因 GFP 示蹤、原位雜交、 RT-PCR 等驗(yàn)證其母源表達(dá)的時(shí)空特異 性，為功能研究提供重要線索?；诒磉_(dá)譜克隆新

21、的母源基因： 通過(guò)亞細(xì)胞分 離等技術(shù)從斑馬魚（或者爪蛙）卵母細(xì)胞中提取 RNA ，通過(guò)差別表達(dá)及深度測(cè) 序等方法發(fā)現(xiàn)新的母源 RNA ，并克隆進(jìn)化上保守的母源基因（如：爪蛙、小鼠 等）。母源因子功能的研究：在 Tol2 轉(zhuǎn)座子純合突變體（ GFP 插入）中，選擇具 有早期形態(tài)發(fā)育異常的突變體，通過(guò) PCR 手段克隆相對(duì)應(yīng)的基因。合成嗎啉環(huán) 修飾的反義寡核苷酸注射受精卵， 通過(guò)胚胎期形態(tài)觀察和分子標(biāo)記等的檢測(cè)， 確 定這些母源基因?qū)π螒B(tài)發(fā)生等的影響是否與相對(duì)應(yīng)的純合突變體一致。 類似的嗎 啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸也可用于基于表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)的母源基因的功能分析， 進(jìn)一 步確定這些母源基因與早期發(fā)育相關(guān)信

22、號(hào)通路的可能相關(guān)作用。 此外，我們也將 建立新的功能缺失分析的新技術(shù)， 例如： 在卵母細(xì)胞中敲低母源基因的技術(shù)。 我 們將選擇重要的母源基因深入研究其在早期發(fā)育中的分子機(jī)理： 在斑馬魚中利用 生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)方法研究它們與 Wnt 、TGF-beta 等信號(hào)通路的遺傳互作。 對(duì)于進(jìn)化中保守的母源基因， 我們將采用小鼠條件基因敲除的方法， 研究它們?cè)?哺乳動(dòng)物中的功能。2. 父源 RNA 的鑒定和功能研究（ 1）關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題 單倍體的精子和單倍體卵子受精產(chǎn)生的受精卵（合子）開始生命的發(fā)育過(guò) 程。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，精子對(duì)下一代（受精卵）的主要貢獻(xiàn)僅限于提供父源的 DNA 。然而近年的研究表明，

23、在受精過(guò)程中， 精子釋放了數(shù)以百計(jì)的各種 mRNA 和小 RNA 進(jìn)入卵子，它們對(duì)合子胚胎的發(fā)育究竟起什么作用、如何起作用，目 前幾乎是一無(wú)所知。這就是本項(xiàng)研究期望解答的科學(xué)問(wèn)題。（2）研究目標(biāo)鑒定由斑馬魚精子提供給卵子的 RNA ，研究它們對(duì)斑馬魚胚胎卵裂、胚層 形成和分化等的影響及其分子機(jī)理， 探討它們與已知在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用的 Wnt 和 TGF-beta 等信號(hào)通路的關(guān)系。（3）研究?jī)?nèi)容父源 RNA 的鑒定：從斑馬魚精子和未受精卵中提取 RNA ，通過(guò)深度測(cè)序 確定存在的 mRNA 和小 RNA ，找出特異性的父源（精源） mRNA 和小 RNA ， 再通過(guò) RT-PCR 等方法驗(yàn)

24、證其特異性。父源 RNA 的保守性的確定：通過(guò)生物學(xué) 信息學(xué)方法比較來(lái)自斑馬魚、豬、人等物種的精子小 RNA 和 mRNA 所編碼的 蛋白，找出保守的父源 mRNA 和小 RNA 。功能性父源 RNA 的鑒定：針對(duì)保守 性父源 RNA ，合成嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸注射受精卵，通過(guò)胚胎期形態(tài)觀 察和少量分子標(biāo)的檢測(cè)初步確定哪些父源基因和小 RNA 具有功能。有重要功能 的父源基因?qū)ε咛グl(fā)育的作用：從初步確定有功能的父源基因和小 RNA 中挑選 部分對(duì)胚胎發(fā)育有明顯影響者，在受精卵中注射反義寡核苷酸或 mRNA ，檢測(cè) 相關(guān)發(fā)育途徑所涉及的基因的表達(dá)和蛋白水平的變化， 確認(rèn)其在胚胎發(fā)育中的功 能

25、和可能涉及的信號(hào)通路。重要父源基因的發(fā)育功能的分子機(jī)理研究：已知 Wnt 、Nodal 、BMP 、FGF 等信號(hào)通路在胚胎的早期發(fā)育中起重要作用，將通 過(guò)生物化學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等方法研究有重要功能的父源基因?qū)@些信號(hào) 通路的可能影響及其在發(fā)育中的遺傳互作。 重要父源基因發(fā)育保守性的研究： 挑 選在斑馬魚上發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)有重要功能的父源基因，在爪蛙上檢驗(yàn)其功能的保守 性。承擔(dān)單位：清華大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所課題負(fù)責(zé)人：孟安明，男， 47 歲，教授，中科院院士，清華大學(xué)生命學(xué)院學(xué)術(shù)骨干：張建，男， 43 歲，研究員，中科院遺傳發(fā)育研究所經(jīng)費(fèi)比例： 28.33%課題二：母源因子

26、在胚層誘導(dǎo)和分化中的作用1、關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題非洲爪蛙是研究母源基因在誘導(dǎo)胚層誘導(dǎo)和分化中的功能的最佳模式動(dòng)物 之一。近二十年的分子發(fā)育生物學(xué)研究表明， 母源轉(zhuǎn)錄因子 VegT 在囊胚中期通 過(guò)激活 Sox17 ， Mixer ，GATA4/5/6 等轉(zhuǎn)錄因子直接啟動(dòng)植物極細(xì)胞的內(nèi)胚層 分化命運(yùn)， 同時(shí)激活內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)并分泌 TGF-beta 家族 Nodal 類生長(zhǎng)因子， 誘導(dǎo)赤道邊緣帶細(xì)胞發(fā)育成中胚層。 而外胚層則在囊胚期動(dòng)物極區(qū)域形成， 并在 原腸運(yùn)動(dòng)中受 BMP 信號(hào)和組織者誘導(dǎo)信號(hào)的調(diào)控分化成表皮以及神經(jīng)系統(tǒng)。囊 胚期外胚層是如何被決定的？是否存在決定外胚層命運(yùn)的母源位置信息？后生 動(dòng)物

27、胚胎早期發(fā)育中普遍存在由母源向合子控制的轉(zhuǎn)換。 斑馬魚、非洲爪蛙以及 果蠅胚胎發(fā)育中的這種轉(zhuǎn)換發(fā)生在囊胚中期， 因此又稱為囊胚中期轉(zhuǎn)換。 合子基 因組的轉(zhuǎn)錄活性如何在囊胚中期被激活？這些問(wèn)題至今尚無(wú)定論。2、研究目標(biāo)該課題計(jì)劃以非洲爪蛙為主要模式動(dòng)物，綜合運(yùn)用正 / 反向遺傳學(xué)、生物化 學(xué)、生物信息學(xué)和組學(xué)等技術(shù)， 從分析新母源基因在誘導(dǎo)早期三胚層形成和分化 的作用入手，實(shí)現(xiàn)如下研究目標(biāo)：、分離和鑒定誘導(dǎo)外胚層生成的母源因子； 、分析母源外胚層誘導(dǎo)因子如何啟動(dòng)外胚層的分化程序；、分析母源外胚層誘導(dǎo)因子與VegT、Nodal、FGF等胚層誘導(dǎo)信號(hào)通路間如何相互作用，決定三 個(gè)早期胚層之間的組織界

28、限形成；、揭示母源因子控制合子基因組在囊胚中期 轉(zhuǎn)錄開放的分子機(jī)制。3、研究?jī)?nèi)容1）建立非洲爪蛙早期外胚層分化的合子基因調(diào)控程序：我們將通過(guò)深度 RNA測(cè)序（RNA-Seq ）確定囊胚中期、原腸胚早期預(yù)定外胚層中特異表達(dá)的合子基因。對(duì)它們的功能進(jìn)行 Gene Ontology 分類，運(yùn)用定量 RT-PCR 驗(yàn)證它們 表達(dá)時(shí)序、 運(yùn)用整體原位雜交方法確認(rèn)它們?cè)谕馀邔又斜磉_(dá)的組織特異性。 同時(shí) 對(duì)在外胚層中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、 分泌型蛋白以及關(guān)鍵信號(hào)通路的調(diào)控蛋白進(jìn) 行功能分析，包括過(guò)量表達(dá)、異位表達(dá)以及嗎啉環(huán)修飾的反義核苷酸介導(dǎo)的敲低。 建立外胚層特異表達(dá)合子基因之間的層級(jí)調(diào)控關(guān)系， 以及它們對(duì)

29、外胚層分化命運(yùn) 的影響。在此基礎(chǔ)上， 我們將進(jìn)一步分析外胚層特異表達(dá)基因與中胚層 （Nodal ， FGF）、內(nèi)胚層（VegT、Nodal ）誘導(dǎo)信號(hào)之間的調(diào)控關(guān)系，以及外胚層和中胚 層組織界限形成的機(jī)制。 2）分離和鑒定決定外胚層形成的母源因子：運(yùn)用計(jì)算 機(jī)輔助全基因組序列分析， 決定外胚層特異表達(dá)基因在基因組上的分布特征， 分 析這些外胚層特異表達(dá)基因的上游調(diào)控序列， 尋找控制外胚層特異基因表達(dá)的保 守調(diào)控元件，并運(yùn)用已知的外胚層特異表達(dá)基因（如Foxi1e/ Xema, FoxH3,XFDL156, xLim-5, SRF, Ectodermin 等）的上游調(diào)控序列進(jìn)行驗(yàn)證，尋找位于 其

30、中的保守調(diào)控元件。 構(gòu)建由這些保守元件驅(qū)動(dòng)的 Luciferase 和 GFP 報(bào)告基因， 分析這些保守元件是否能控制報(bào)告基因在外胚層中的特異表達(dá)。 同時(shí)對(duì)這些保守 元件進(jìn)行突變和缺失分析， 建立相關(guān)系列報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因胚胎， 分析這些保守 調(diào)控元件的必要性。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建外胚層特異的保守啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的酵母單雜交報(bào)告系統(tǒng)，對(duì) Unigene 母源 cDNA 文庫(kù)進(jìn)行篩選，分離與這些調(diào)控序 列結(jié)合的母源因子。體外合成這些母源因子的 mRNA ，設(shè)計(jì)并合成特異的反義 寡核苷酸，分別對(duì)它們進(jìn)行過(guò)量表達(dá)和敲低功能分析。 運(yùn)用 ChIP-on-chip 技術(shù)， 分析這些母源轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控的合子靶

31、基因， 揭示這些母源因子控制囊胚期外 胚層形成的機(jī)制。我們的前期研究工作已經(jīng)獲得三個(gè)新的母源基因?qū)ν馀邔拥恼T 導(dǎo)具有調(diào)控作用，它們分別屬于 Tbx 、 Zinc-finger 和 bHLHZip 家族轉(zhuǎn)錄因子。 進(jìn)一步的研究將揭示它們的功能作用機(jī)制。 3）母源因子在調(diào)控囊胚中期合子基 因組轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)換中的功能： 囊胚中期轉(zhuǎn)換存在于多數(shù)后生動(dòng)物早期發(fā)育中， 期 間，合子基因組轉(zhuǎn)錄大規(guī)模開放， 包括受母源位置信息控制的胚層特異基因的區(qū) 域性表達(dá)。與之相伴發(fā)生的是母源基因的大規(guī)模降解、 細(xì)胞周期特征的改變和胚 胎細(xì)胞遷移活性的獲得。 這些現(xiàn)象是受獨(dú)立控制還是相互關(guān)聯(lián)， 是脊椎動(dòng)物早期 發(fā)育研究的重大

32、問(wèn)題之一。 我們?cè)谶M(jìn)行母源基因敲低功能分析過(guò)程中獲得幾個(gè)候 選母源轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白甲基化修飾酶， 它們的缺失顯著地降低合子基因組在囊 胚期的轉(zhuǎn)錄活性， 并對(duì)細(xì)胞周期行為有一定影響。 我們計(jì)劃綜合運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組和蛋 白質(zhì)化學(xué)研究手段， 對(duì)這些母源基因在囊胚中期轉(zhuǎn)換中的功能作深入分析， 檢驗(yàn) 以下三種假說(shuō)： 其一，大量?jī)?chǔ)備的母源轉(zhuǎn)錄抑制因子或者表觀遺傳修飾因子抑制 合子基因組的過(guò)早開放；其二，母源 RNA Pol II 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物組分的表達(dá)量過(guò)低 或者不能有效裝配；其三，快速的細(xì)胞分裂不利于轉(zhuǎn)錄的起始或者 / 和延伸。承擔(dān)單位：清華大學(xué)，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所課題負(fù)責(zé)人：陶慶華，男， 39 歲，教授，清

33、華大學(xué)生命科學(xué)院 主要學(xué)術(shù)骨干：趙亞輝，男， 35 歲，副研究員，中科院動(dòng)物研究所 經(jīng)費(fèi)比例： 18.67%課題三：發(fā)育關(guān)鍵信號(hào)通路的新介導(dǎo)因子對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控作用1、關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題Wnt和TGF-beta是兩條重要的信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育和成體組織動(dòng)態(tài)平衡 維持中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。其精確調(diào)控的喪失在發(fā)育階段會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異 常，在成體中會(huì)導(dǎo)致癌癥，如結(jié)腸癌、乳腺癌，以及其他疾病的發(fā)生。在早期胚 胎中， Wnt 信號(hào)通路參與了胚層背腹軸向分化調(diào)控、 細(xì)胞極性建立和胚胎原腸運(yùn) 動(dòng)等多個(gè)發(fā)育過(guò)程。 TGF-beta 超家族成員在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中也參與胚層的 誘導(dǎo)形成以及體軸的確定等過(guò)程。并且

34、，Wnt和TGF-beta信號(hào)通路在不同的層面有著廣泛的 cross-talk ，往往協(xié)同調(diào)控胚胎發(fā)育事件。例如， Wnt 信號(hào)通路中 的Axin能通過(guò)Arkadia促進(jìn)Smad7的降解，從而上調(diào)TGF-beta信號(hào)；Smad4和Wnt通路中的beta-catenin 以及LEF1的相互作用在Spemanns organizer的形 成中起著重要的作用；Smad4和Wnt信號(hào)調(diào)控分子APC的突變?cè)诮Y(jié)腸癌發(fā)生中 都有 作用；Smad7和beta-catenin 以及LEF1/TCF4之間的相互作用對(duì)于 TGF-beta誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起著重要的作用；Wnt通路中的Dvl1和Axin都與TGF-be

35、ta 信號(hào)分子 Smad3 有相互作用。本課題的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題是在胚胎發(fā)育， 特別是胚層誘導(dǎo)形成和分化過(guò)程中， TGF-beta與Wnt信號(hào)是如何發(fā)揮作用的。 我們將主要利用爪蛙胚胎和小鼠/人胚胎干細(xì)胞，研究Wnt和TGF-beta信號(hào)的新 的調(diào)控因子和調(diào)控機(jī)制， 同時(shí)，特別關(guān)注這兩條信號(hào)通路在胚層誘導(dǎo)形成和分化 調(diào)控中的協(xié)同作用。2、研究目標(biāo)該課題計(jì)劃以爪蛙和胚胎干細(xì)胞為研究體系， 必要時(shí)也會(huì)利用斑馬魚和小鼠 研究系統(tǒng)，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)、分子、生化等研究技術(shù)，從鑒定新的 TGF-beta 以及 Wnt 信號(hào)的調(diào)控因子和靶基因入手，探索這兩條信號(hào)通路在胚層形成以及分化 調(diào)控中的機(jī)制，實(shí)現(xiàn)如下研究目標(biāo)

36、：、鑒定 TGF-beta信號(hào)的新的調(diào)控因子和 調(diào)控機(jī)制，分析他們?cè)谂邔有纬珊头只械墓δ?；、鑒定Wnt信號(hào)的新的調(diào)控因子和調(diào)控機(jī)制，分析他們?cè)谂邔有纬珊头只械墓δ?；、鑒定受TGF-beta 和/或 Wnt 信號(hào)調(diào)控的直接靶基因， 分析這些靶基因在胚層形成以及分化中的功 能；分析TGF-beta和Wnt信號(hào)在胚層形成和分化中的協(xié)調(diào)和交互作用。另 外，我們還將同其他三個(gè)課題合作， 利用他們發(fā)現(xiàn)的新基因等共同楊本項(xiàng)目的核 心科學(xué)問(wèn)題。3、研究?jī)?nèi)容：為了發(fā)現(xiàn)新的、 有重要功能的調(diào)控基因， 在整體上理解胚胎發(fā)育中胚層形成 和分化調(diào)控的內(nèi)在機(jī)理，我們將主要進(jìn)行以下幾方面的研究。1）新的調(diào)控TGF-be

37、ta與Wnt通路的分子機(jī)制：經(jīng)過(guò)近 20 30年的研究，TGF-beta和Wnt 通路的主要成員大都被發(fā)現(xiàn)， 已經(jīng)建立起了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控的框架。 但是，新的 試驗(yàn)方法和技術(shù)的出現(xiàn)，讓我們有了新的工具來(lái)研究他們的調(diào)控。我們將利用RNAi文庫(kù)，從基因組水平來(lái)篩選TGF-beta和Wnt通路的調(diào)控分子。TGF-beta 的受體TGFbetaRI和TGFbetaR2，Smad蛋白是TGF-beta通路中的主要成員， 各種各樣的翻譯后修飾是調(diào)控他們功能的重要方式， 其中研究最多的是磷酸化和 去磷酸化。 我們克隆了人類基因組所有被注釋的激酶和去磷酸化酶， 利用這些資 源我們將研究磷酸化和去磷酸化對(duì) TGF

38、-beta和Wnt信號(hào)通路的調(diào)控。組學(xué)水平 的研究，能讓我們更全面的了解TGF-beta和Wnt信號(hào)通路的調(diào)控。2） TGF-beta 與Wnt信號(hào)相關(guān)因子在早期胚胎發(fā)育中的作用和分子機(jī)制：TGF-beta信號(hào)，特別是其中的 Nodal 信號(hào)在胚胎發(fā)育過(guò)程中起了重要作用， 很多信號(hào)通路中的關(guān)鍵 分子，比如受體和 Smads ，在胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能研究已經(jīng)取得了重要成果。 近些年的研究表明，還有很多參與 TGF-beta 信號(hào)調(diào)控的分子沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。我們 在前期研究中發(fā)現(xiàn)了多個(gè) TGF-beta/Nodal 信號(hào)的介導(dǎo)因子（如斑馬魚 Smad3a 、 Smad3b ）或調(diào)控因子（如 Dapper

39、2 、 BAMBI ）相互作用的因子。還發(fā)現(xiàn)了一些在缺失 Nodal 信號(hào)的斑馬魚突變體中表達(dá)下降的基因，這些因子 / 基因在胚胎 發(fā)育中的功能或?qū)?TGF-beta 信號(hào)通路的調(diào)控作用并不清楚。我們將研究這些因 子/ 基因在斑馬魚和爪蛙胚胎早期發(fā)育中的功能，并利用體外系統(tǒng)闡明它們?cè)?TGF-beta 信號(hào)通路中的作用及其機(jī)理。同樣，多個(gè) Wnt 信號(hào)的調(diào)控因子已被發(fā) 現(xiàn)在胚胎早期發(fā)育中起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用， 但其受體激活機(jī)制等關(guān)鍵調(diào)控步驟 仍很不清楚。而且人們對(duì) Wnt 信號(hào)在上述每一個(gè)發(fā)育過(guò)程中到底如何調(diào)控細(xì)胞分 化幾乎一無(wú)所知。 針對(duì)這一問(wèn)題， 目前我們已經(jīng)鑒定到多個(gè)調(diào)控 Wnt 信號(hào)的

40、爪蛙 基因，都可能以新的調(diào)控機(jī)制參與 Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控。 接下來(lái)我們將深入研究 這幾個(gè)基因的調(diào)控機(jī)制和生理功能。3）探討TGF-beta與Wnt通路之間的交互作 用和整合如何影響早期胚胎發(fā)育：信號(hào)通路除了能各自調(diào)節(jié)自身下游靶基因以 外，還能相互協(xié)調(diào)整合、 共同參與對(duì)某些下游靶基因的調(diào)節(jié)。 我們將鑒定同時(shí)受 TGF-beta 與 Wnt 信 號(hào) 調(diào) 控的 下游 基 因 。 針 對(duì) 這 一 問(wèn) 題 ， 我 們將 借 助 ChIP-on-chip 、Chip-seq 等技術(shù)，尋找斑馬魚和爪蛙早期發(fā)育中的 TGF-beta 和Wnt通路中的靶基因。我們已經(jīng)建立了干細(xì)胞的研究平臺(tái)，TGF-beta

41、和Wnt通路在干細(xì)胞的自我更新和復(fù)制中起著重要的作用， 我們也將在小鼠胚胎干細(xì)胞 中鑒定TGF-beta和Wnt的靶基因。新的靶基因的發(fā)現(xiàn)能讓我們更好地了解 TGF-beta和Wnt通路的功能。此外，我們?cè)谶^(guò)去的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些因子 對(duì)TGF-beta與Wnt通路有復(fù)雜的調(diào)控作用，例如BAMBI蛋白既能參與上調(diào) Wnt 通路同時(shí)又是一個(gè)重要的 TGF-beta 通路的抑制因子。對(duì)于這類的蛋白因子，研 究它在早期胚胎發(fā)育的不同時(shí)期發(fā)揮的功能，將是我們今后工作的另一個(gè)重點(diǎn)。 我們還將著手建立一套基于TGF-beta與Wnt通路報(bào)告基因的雙熒光篩選系統(tǒng)， 以期發(fā)現(xiàn)更多的類似 BAMBI 這樣同時(shí)

42、作用于兩條通路的調(diào)控因子。此外，近年 發(fā)現(xiàn)胰島素樣（IGF）信號(hào)通路對(duì)胚層的分化也有影響，我們將探討一些IGF結(jié)合蛋白（IGFBP）對(duì)胚層分化的影響及其與 TGF-beta和Wnt信號(hào)通路之間的互 作關(guān)系。承擔(dān)單位：清華大學(xué)，中國(guó)海洋大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人：吳畏，男， 41 歲，教授，清華大學(xué)生命科學(xué)院 主要學(xué)術(shù)骨干：陳曄光，男， 45 歲，教授，清華大學(xué)生命科學(xué)院 李筠，女， 42 歲，教授，中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院經(jīng)費(fèi)比例： 29.67%課題四：多能性因子在胚層誘導(dǎo)和分化中的作用1、關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：多能性因子，主要包括 Oct4 、Klf4 、Sox2 、c-Myc 、nanog 等轉(zhuǎn)錄因子， 不僅具

43、有維持哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和自我更新的能力， 而且能夠?qū)?分化的成體細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能性的干細(xì)胞。另一方面， RA 信號(hào)可以將胚胎干細(xì) 胞誘導(dǎo)分化成源自不同胚層的細(xì)胞。 盡管這些多能性因子或信號(hào)在再生醫(yī)學(xué)研究 領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用， 然而，目前對(duì)它們?cè)跊Q定干細(xì)胞的命運(yùn)中如何發(fā)揮作用的 機(jī)制的了解還十分有限。 它們作為轉(zhuǎn)錄因子是如何拮抗多種促分化信號(hào)？如何與 表觀遺傳控制機(jī)制協(xié)同維持胚胎干細(xì)胞的分化潛能？這些多能性因子、 RA 信號(hào) 中的不同信號(hào)傳遞因子在多種脊椎動(dòng)物的卵母細(xì)胞和未分化胚胎細(xì)胞中都有高 表達(dá)，為我們探索這些多能性因子在正常發(fā)育過(guò)程中調(diào)控早期胚胎細(xì)胞的分化命 運(yùn)的機(jī)理提供了理

44、想的研究模型。2、研究目標(biāo)：綜合運(yùn)用非洲爪蛙、斑馬魚、胚胎干細(xì)胞的模型系統(tǒng)研究多能性因子，主 要是 Oct4 和 Klf4 同源因子在胚層分化中的功能、它們對(duì)胚層分化的遺傳和表 觀遺傳調(diào)節(jié)。揭示多能性因子與促胚層分化信號(hào)（主要是 TGF-beta 、Wnt 、RA 信號(hào)通路） 之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系； 從多層面較為透徹地了解多能性因子如何經(jīng)由 塑造染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄感受性來(lái)決定早期胚胎細(xì)胞的分化狀態(tài)。3、研究?jī)?nèi)容：1）Klf4 家族多能性因子在胚層分化中的功能和作用機(jī)制： Klf4 、Klf2 、Klf5 同屬 Kruppel-like factor 家族轉(zhuǎn)錄因子，它們?cè)谂咛ジ杉?xì)胞中都有表達(dá)，但是 它們

45、在脊椎動(dòng)物胚胎早期發(fā)育中的確切功能還未見(jiàn)報(bào)到。 因此，我們將運(yùn)用非洲 爪蛙早期胚胎模型， 深入分析、 比較三者在胚層分化過(guò)程中功能的異同。 我們已 經(jīng)利用定量 RT-PCR 和整體原位雜交的方法完成檢測(cè) Klf4 、Klf2 、Klf5 的時(shí)空 表達(dá)。已經(jīng)獲得這些基因的過(guò)量表達(dá)載體和特異的嗎啉反義寡核苷酸用于敲低實(shí) 驗(yàn)，分析 Klf2 、Klf4 或 Klf5 對(duì)胚層分化的影響。并將通過(guò)交叉拯救實(shí)驗(yàn)，區(qū)分 三者在胚層分化中的功能異同。 運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因、 蛋白質(zhì) -DNA 結(jié)合實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)免疫共沉淀等手段，揭示不同 Klf 因子產(chǎn)生相似或不同功能的原因。與此 同時(shí)，我們還將通過(guò)報(bào)告基因、

46、EMSA 、Co-IP/GST-pulldown 、染色質(zhì)免疫共 沉淀等離體（ in vitro ）、在體（ in vivo ）的蛋白 -DNA 結(jié)合等實(shí)驗(yàn)，分析 Klf 家族轉(zhuǎn)錄因子對(duì)母源 VegT 、beta-catenin 以及合子 Nodal 信號(hào)通路活性的調(diào) 控，揭示 Klf 家族轉(zhuǎn)錄因子與已知促胚層分化信號(hào)通路間的相互作用機(jī)制。在斑 馬魚系統(tǒng)中檢驗(yàn) Klf 家族多能性因子的發(fā)育功能和機(jī)理的進(jìn)化保守性。 2）Klf 和 Oct4 同源因子 Oct25 之間的協(xié)同作用對(duì)胚層分化的影響：我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn) 中已經(jīng)觀察到 Klf4 和 Oct25 在胚層分化過(guò)程中具有協(xié)同作用，將進(jìn)一步利用基

47、因表達(dá)芯片，在單獨(dú)過(guò)量表達(dá)或者敲低 Klf4 和 Oct25 的實(shí)驗(yàn)條件下，鑒別受 Klf4 與Oct25共同調(diào)節(jié)的靶基因。再用離體（EMSA）或在體（ChIP）驗(yàn)證Klf4和 Oct25 可以同時(shí)結(jié)合這些共同靶基因的調(diào)控序列。運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因的手 段驗(yàn)證兩個(gè)蛋白對(duì)目的基因的調(diào)節(jié)效應(yīng)。 并在干細(xì)胞中對(duì) Klf4 和 Oct25 之間的 相互作用機(jī)制的保守行作進(jìn)一步研究。 3） Klf4 、Oct4 等多能性轉(zhuǎn)錄因子與組蛋 白修飾相關(guān)的表觀遺傳控制因子之間的相互作用。 綜合運(yùn)用過(guò)量表達(dá)、基因敲低、 定量 RT-PCR、Western Blotting 、Co-IP/GST-Pulldown

48、、EMSA、ChIP、報(bào) 告基因分析等實(shí)驗(yàn)手段， 檢測(cè)在胚層分化過(guò)程中， Klf4 和 Oct4 同組蛋白表觀遺 傳控制因子之間可能存在的三種作用方式：其一，Klf4和Oct4是否控制表觀遺傳修飾因子編碼基因的表達(dá)；其二，組蛋白修飾酶是否對(duì) Klf4 、 Oct4 等多能性 因子基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用；其三， Klf4、 Oct4 與組蛋白修飾酶是否在共同 的靶基因啟動(dòng)子區(qū)域協(xié)同作用。 4）確立母源性 RA 在胚層分化中的功能和機(jī)制。 在斑馬魚中利用嗎啉反義寡核苷酸敲降或 mRNA 過(guò)表達(dá)的方法檢測(cè) RA、 RA 代 謝酶（包括 RA 降解酶 Cyp26 和合成酶 Aldh1a ）以及 RA

49、信號(hào)通路中輔阻遏因 子（N-CoR和SMRT）在胚層分化中的功能。通過(guò)研究母源性的輔阻遏因子（N-CoR和SMRT）在無(wú)RA的區(qū)域?qū)θ旧w重塑的影響，確立 RA信號(hào)通路 母源性信息是否通過(guò)控制表觀遺傳的改變而決定胚層的形成和分化。 在爪蛙中驗(yàn) 證相關(guān)因子功能的進(jìn)化保守性。5）揭示母源性 RA 信號(hào)是否通過(guò)調(diào)控早期多能性因子或其它早期信號(hào)如 Wnt 、 TGF-beta 影響胚層的形成和分化。 通過(guò)改變受 精卵內(nèi) RA 信號(hào)，研究早期多能性因子或其它早期信號(hào)如 Wnt 、 TGF-beta 等的 表達(dá)是否受 RA 信號(hào)的調(diào)控。 結(jié)合生物信息學(xué)和體外轉(zhuǎn)錄分析， 確立這些調(diào)控作 用的分子生物學(xué)機(jī)制。

50、承擔(dān)單位：南京大學(xué)，復(fù)旦大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：曹螢，男， 43 歲，教授，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所 主要學(xué)術(shù)骨干：趙慶順，男， 45 歲，教授，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所 姚紀(jì)花，女， 44 歲，副教授，復(fù)旦大學(xué)遺傳所經(jīng)費(fèi)比例： 23.33%（三）課題之間的聯(lián)系本項(xiàng)目的四個(gè)課題各有側(cè)重，如課題 1 和課題 2 的研究側(cè)重于研究母源和 父源分子對(duì)胚胎發(fā)育的調(diào)控作用，課題 1 以斑馬魚系統(tǒng)為主，課題 2 以爪蛙系 統(tǒng)為主；課題 3 以 Wnt 和 TGF-beta 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)新的機(jī)理研究為主，側(cè)重于哺乳 動(dòng)物細(xì)胞系；課題 4 重點(diǎn)研究干細(xì)胞多能性相關(guān)的 Klf 家族因子和 RA 信號(hào)通路 因子的發(fā)育功能。 但是

51、，各課題之間又有密切的聯(lián)系和合作。例如， 課題 1 和課 題 2 發(fā)現(xiàn)的有重要功能的親源分子以及課題 4 發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞多能因子將與課題 3 合作，研究它們?cè)?Wnt 、TGF-beta 等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用；課題 3 發(fā)現(xiàn)的 Wnt 、 TGF-beta 信號(hào)的新調(diào)節(jié)因子或靶基因，可以通過(guò)與課題 1 、2 合作研究它們?cè)?斑馬魚和爪蛙胚層形成和分化中的作用， 與課題 3 合作研究其在多能性維持中的 作用。課題 1 發(fā)現(xiàn)的斑馬魚重要親源分子可通過(guò)與課題 2 合作，研究其在爪蛙 中的發(fā)育功能保守性，與課題 4 合作研究其在干細(xì)胞多能性相關(guān)信號(hào)通路中的潛 在作用。課題 2 發(fā)現(xiàn)的爪蛙重要母源因子可通過(guò)

52、與課題 1 合作探討其在斑馬魚 胚胎中的作用。 總之，不同課題間的密切合作將有力地促進(jìn)高水平研究成果的產(chǎn) 出。四、年度計(jì)劃年度計(jì)劃內(nèi)容和目標(biāo)研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)1 ）構(gòu)建三種新型的Tol2基因捕獲1 ）完善基于Tol2轉(zhuǎn)座子的基因捕載體；建立不少于10000條魚的轉(zhuǎn)獲系統(tǒng)，在斑馬魚上大量獲得F0群座子基因捕獲F0群體。體。2 ）鑒定出一批母源、父源特異性和2）利用深度測(cè)序法，鑒定斑馬魚母胚層特異性表達(dá)基因。源和父源特異性表達(dá)基因；研究爪蛙3）闡明10個(gè)作用母源因子的發(fā)育囊胚期和原腸早期外胚層轉(zhuǎn)錄組特功能。第點(diǎn)。4）鑒定出 TGF-beta、Wnt、IGF3）研究前期工作鑒定的多個(gè)母源因信號(hào)相關(guān)的多

53、個(gè)新調(diào)控因子，初步揭子（如 Tbx、Zinc-finger、bHLHZip、示新分子與相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控關(guān)Trithorax、PcG、BTB-POZ、Norrin、系和在細(xì)胞中的大致作用機(jī)理。年Klf4、Klf2、Klf5、aldh1a2 和5）初步明確卵母細(xì)胞中基因組轉(zhuǎn)錄cyp26a1等）等在斑馬魚或爪蛙早抑制物質(zhì)是以蛋白質(zhì)還是RNA發(fā)揮期胚胎發(fā)育中的作用，尤其是在中囊作用。胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導(dǎo)和分化中的作用。6）發(fā)表SCI論文6-10篇。4 ）通過(guò)大量表達(dá)、RNA干擾、蛋7 ）培養(yǎng)畢業(yè)博士生8-12名白組學(xué)、Chip-chip 等技術(shù)篩選TGF-beta、Wnt、IGF 等信號(hào)通路研究?jī)?nèi)容預(yù)期

54、目標(biāo)相關(guān)因子。5）對(duì)卵母細(xì)胞及終末分化紅細(xì)胞核基因組轉(zhuǎn)錄抑制物質(zhì)作初步分析。研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)1 ）在斑馬魚上基于F0基因捕獲群1）獲得5 10個(gè)斑馬魚母源基因體篩選F1個(gè)體和建立F2群體；對(duì)插入突變體，克隆其中5個(gè)突變基F2群體進(jìn)行突變表型篩選，并進(jìn)行因，初步了解其在早期發(fā)育中的功插入點(diǎn)的基因克隆。能。2）在斑馬魚和爪蛙上對(duì)鑒定的新的2）在斑馬魚上初步了解母源去甲基母源和父源因子進(jìn)行大規(guī)模的功能化酶、蛋白酶抑制因子等對(duì)中囊胚轉(zhuǎn)分析。換、胚層誘導(dǎo)和分化的作用；并初步3）探討分析母源因子及 Klf因子、確認(rèn)3-5個(gè)有發(fā)育功能的父源特異第RA信號(hào)通路輔阻遏因子 N-CoR、性基因。SMRT等在三個(gè)胚

55、層形成和分化中3）在斑馬魚和爪蛙上闡明幾個(gè)母源二的交互調(diào)控關(guān)系及其與TGF-beta因子在調(diào)控胚層決定和分化的作用，和Wnt信號(hào)通路間的相互作用機(jī)初步揭示它們的作用機(jī)制；闡明 Klf年制；探討組蛋白H3甲基化在外胚層因子調(diào)節(jié)爪蛙胚層形成的分子機(jī)制。命運(yùn)決定過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。4）獲得非洲爪蛙終末分化紅細(xì)胞核4）對(duì)非洲爪蛙終末分化紅細(xì)胞因子中全基因組轉(zhuǎn)錄抑制物質(zhì)的基cDNA文庫(kù)進(jìn)行過(guò)量表達(dá)功能篩選；因身份，初步揭示期作用機(jī)理，確定5）繼續(xù)篩選受TGF-beta、Wnt以其在囊胚中期轉(zhuǎn)換中的作用。及IGF信號(hào)調(diào)控的直接靶基因；對(duì)5）初步闡明部分 TGF-beta、Wnt鑒定到的影響TGF-beta、

56、Wnt以及和IGF通路相關(guān)因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中IGF信號(hào)的調(diào)控因子，開始進(jìn)行基因的作用；揭示其在爪蛙、斑馬魚早期功能研究，分析它們調(diào)控信號(hào)的機(jī)胚胎發(fā)育中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)制，分析它們?cè)谂咛グl(fā)育中的表達(dá)模6 ）鑒別出受Klf4和Oct25共同調(diào)式，通過(guò)基因過(guò)量表達(dá)和功能缺失，節(jié)的、與胚層分化狀態(tài)相關(guān)的基因。探索它們可能的功能。7）發(fā)表SCI論文10-15篇。6）利用非洲爪蛙基因表達(dá)芯片鑒定8 ）培養(yǎng)畢業(yè)博士生10-13名。Klf4和Oct25協(xié)同調(diào)節(jié)的基因。研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)1 ）繼續(xù)增加F1插入斑馬魚個(gè)體以1）獲得5 - 10個(gè)斑馬魚母源基因及F2家系，增加F3突變體的篩選插入突變體，

57、 克隆其中5個(gè)突變基數(shù)目；克隆突變體中的突變基因，因；闡明3-5個(gè)母源突變體的分子機(jī)研究其作用的分子機(jī)理。理。2）繼續(xù)深入研究母源和父源因子調(diào)2）闡明5-10個(gè)母源和父源因子的控中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導(dǎo)和分化的發(fā)育功能和機(jī)理。分子機(jī)制。3）深入了解爪蛙外胚層命運(yùn)決定的第3）深入研究終末分化紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑遺傳和表觀遺傳控制機(jī)制、終末成熟制物質(zhì)在卵母細(xì)胞和早期胚胎中調(diào)卵母細(xì)胞中外源報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性三控報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制?？刂茩C(jī)制、母源轉(zhuǎn)錄因子控制合子基4）繼續(xù)深入研究RA信號(hào)通路組份因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。年和鑒定的TGF-beta、Wnt和IGF4）進(jìn)一步明確鑒定的 TGF-beta、信號(hào)通路調(diào)控因子和靶基因在信號(hào)Wnt和IGF信號(hào)通路調(diào)控