病毒轉(zhuǎn)染原理及步驟

1、病毒轉(zhuǎn)染原理及步驟在細(xì)胞相關(guān)的實驗操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 通過病毒介導(dǎo)的實驗?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率， 以達(dá)到目的基因的高效瞬時 表達(dá)。病毒轉(zhuǎn)染包括以下步驟：1構(gòu)建載體2包裝提純病毒3感染靶細(xì)胞。以慢病毒 為例。慢病毒(Lentivirus )載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來 的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具 有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將 外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可 有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)

2、胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多 種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究， 效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。一、慢病毒載體構(gòu)建原理：慢病毒載體的包裝系統(tǒng)一般由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、 逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及 在此位點插入的目的基因。將包裝成分與載體成分的多個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞， 即可在細(xì)胞上清中收獲攜帶目的基因的復(fù)制缺陷型慢病毒載體顆粒。慢病毒表達(dá)載體包含了包

3、裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝 質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝 RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋 白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心 取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后， 經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi，cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。對進(jìn)行穩(wěn)

4、轉(zhuǎn) 細(xì)胞株的篩選，為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液提供基 礎(chǔ)。二、慢病毒載體構(gòu)建及包裝流程：（一）實驗流程（1和2為并列步驟）1慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建設(shè)計上下游特異性擴(kuò)增引物，同時引入酶切位點，PCR（采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%）從模板中（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸欤┱{(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequenc0連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝 入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。2. 慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體3慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行

5、 高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基, 培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液 通過超離心濃縮病毒。（二）實驗材料：慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的 ZsGreen1 表達(dá)框能 表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。細(xì)胞株293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培 養(yǎng)基為DMEM（含10% FBS）。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。菌株大腸桿菌菌株DHa。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。

6、、慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實驗方法（一）慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞實驗方法1、慢病毒轉(zhuǎn)染前18-24小時，將貼壁細(xì)胞以1X105/孔鋪到24孔板中。使細(xì)胞在 慢病毒轉(zhuǎn)染時的數(shù)量為2X105/孔左右。2、第二天，用含有6卩g/ml polybren的 2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入 適量病毒懸液。37 T孵育。3、（對polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟）4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以 稀釋 polybrene。4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培5、 繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉(zhuǎn)染48小時后可見明顯熒光表達(dá)，72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉(zhuǎn)染效率，可在轉(zhuǎn)染后 72-96

7、小 時進(jìn)行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥。（二）慢病毒轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞實驗方法1、在2X105/ml懸浮細(xì)胞中加入polybrene至6卩g/m和適量病毒，充分混勻。37C孵育?；蛘?50g室溫離心4小時（選作，部分難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系采用此步 驟可以提高轉(zhuǎn)染效率）。2、 （對polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟）4小時后（或離心結(jié)束后）加入等 體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybre ne。3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。中間視細(xì)胞生長情況可傳代或換液。病毒感染細(xì)胞本來效率就較低，一定要注意以下幾點：1.感染時的培養(yǎng)基盡量少些；2.每1ml的培養(yǎng)基中加入5-10ul的Polybrene（儲存液濃度為2mg/ml），可 以提高效率約3-5倍。不過病毒感染效率的問題都是相對的，達(dá)到自己的研究目 的即可。北京英格恩生物公司最新研發(fā)合成一種新型納米聚合物病毒感染增強(qiáng)試劑（病 毒轉(zhuǎn)染試劑）Envirus，具有對病毒吸附和獨有的濃縮功能。Envirus通過物理 作用將病毒大量富集在細(xì)胞表面，大大增加病毒與細(xì)胞的接觸，最大限度促進(jìn)病 毒感染細(xì)胞，可大大提高腺病毒，慢病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒的感 染效率，并且細(xì)胞毒性很小。通常情況下，比不用EnvirusTM增強(qiáng)劑，提高感染效率20-50倍。virus only virus+Polybrene vi