熒光顯微鏡的原理和使演示課件

1、1 特殊顯微鏡的使用（特殊顯微鏡的使用（3） 熒光顯微鏡的原理及其應(yīng)用熒光顯微鏡的原理及其應(yīng)用 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂?、?shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握熒光顯微鏡的原理和使用方法 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 熒光顯微鏡(fluorescence microscope) 是熒光顯微 術(shù)的基本裝置。熒光顯微術(shù)是利用一定波長(zhǎng)的光 （通常是波長(zhǎng)短的紫外光和藍(lán)紫光）照射被檢樣 品，激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出可見(jiàn)的熒光。通過(guò)物鏡和 目鏡的成像、放大，以供檢視和拍攝。熒光顯微 鏡具特殊光源，提供足夠強(qiáng)度和波長(zhǎng)的激發(fā)光， 誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。視場(chǎng)中所見(jiàn)的像，主要 是樣品的熒光映像。 2 某些物質(zhì)經(jīng)波長(zhǎng)較短的光線(xiàn)照射后，分子被激活， 吸收能量

2、后呈激發(fā)態(tài)。其能量部分轉(zhuǎn)化為熱量或 用于光化學(xué)反應(yīng)外，相當(dāng)一部分則以波長(zhǎng)較長(zhǎng)的 光能形式輻射出來(lái)，這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見(jiàn) 光稱(chēng)作熒光。生物體內(nèi)有些物質(zhì)受激發(fā)光照射后 可直接發(fā)出的熒光，稱(chēng)為自發(fā)熒光（如葉綠體中 的葉綠素分子受激發(fā)所發(fā)出的火紅色的熒光）； 本身不發(fā)熒光，在吸收熒光染料之后所發(fā)出的熒 光稱(chēng)為次生熒光。常用的熒光染料包括丫啶橙、 熒光素、羅丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。 細(xì)胞內(nèi)大部分物質(zhì)經(jīng)短光波照射后，可發(fā)出較弱 的自發(fā)性熒光。有些細(xì)胞成分與能發(fā)出熒光的有 機(jī)化合物熒光染料結(jié)合。激發(fā)后呈現(xiàn)一定顏 色的熒光，借以對(duì)組織進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)的觀察和研 究。 3 2.1 熒光顯微鏡的基本

3、裝置及其光路 熒光顯微鏡因制造廠家、型號(hào)的不同，結(jié)構(gòu) 各異，但主要構(gòu)件，基本相同。 2.1.1光源:采用高壓汞燈。汞燈能以最小的表面 發(fā)出最大數(shù)量的紫外光和藍(lán)光，且光亮度大，光 度穩(wěn)定。汞燈的構(gòu)件，中間為一球形石英玻璃管， 有兩個(gè)鎢電極，內(nèi)充汞滴和少量氬氖混合氣體。 汞燈裝在牢固的燈室中，有調(diào)中、聚焦和集光裝 置。使用中嚴(yán)禁頻繁啟閉，點(diǎn)亮后欲暫停使用時(shí)， 不可切斷電源，可用光閥阻斷光路。當(dāng)汞燈熄滅 后，不能立刻點(diǎn)亮，經(jīng)510min，汞燈冷卻后再 通電點(diǎn)亮。 HBO200汞燈的發(fā)射光譜為200600nm， 其中在365nm和435nm處有兩個(gè)高峰。 4 2.2.2濾色鏡系統(tǒng):熒光顯微術(shù)的濾色鏡，

4、按用途 或功能，主要分為下列兩類(lèi)： 激發(fā)濾色鏡（激發(fā)濾色鏡（exciter filter）: :激發(fā)濾色鏡的作 用，在于為被檢樣品的熒光染料提供最佳波段的 激發(fā)光。熒光染料均有一定的吸收光譜（激發(fā)峰 值），利用濾色鏡對(duì)光線(xiàn)選擇吸收的能力，選用 其透射光譜，恰為熒光染料的最大吸收光譜（激 發(fā)高峰）的激發(fā)濾色鏡，以便從汞燈發(fā)出的廣譜 光波中，選擇透過(guò)最宜波段的光線(xiàn)供用。 激發(fā)濾色鏡加放于汞燈和二向色鏡（dichotic mirror）之間，物鏡之前。濾鏡的型號(hào)不同，數(shù)量 較多，可按不同需要選用。 5 阻斷濾色鏡（阻斷濾色鏡（barrier filter）: :阻斷濾色鏡 位于物鏡之上，二向色鏡和目

5、鏡之間，用 以阻斷或吸收光路中的激發(fā)光或某些波長(zhǎng) 較短的光線(xiàn)，以防傷害眼睛，使熒光透過(guò)。 選用的原則，以能完全阻斷或吸收波長(zhǎng)短 于所需熒光的光線(xiàn)，并透過(guò)樣品發(fā)出的熒 光。所以，阻斷濾色鏡的選用，應(yīng)視熒光 染料的熒光光譜而定，以能最大限度地透 過(guò)熒光和阻斷短波光。 6 二向色鏡（二向色鏡（chromatic beam splitter）:熒光 顯微鏡中，除上述兩類(lèi)濾色鏡外，尚有一 重要的分色鏡系統(tǒng)二向色鏡位于汞燈 汞激發(fā)濾色鏡構(gòu)成的水平光軸與目鏡和物 鏡構(gòu)成的豎直光軸的兩軸垂直相交處，斜 向安裝于光路之中。由鍍膜的光學(xué)玻璃制 成，其鏡面方位與上述兩光軸交角均呈 45，兼有透射長(zhǎng)波光線(xiàn)和反射短波光

6、線(xiàn) 的功能。在熒光顯微術(shù)中承當(dāng)色光的“分 流”作用。 7 2.2.3熒光顯微鏡的光路 熒光顯微鏡的光學(xué)原理圖根據(jù)照明方式的 不同，熒光顯微鏡分為落射式熒光顯微鏡和透 射式熒光顯微鏡兩種。目前常用的是落射式熒 光顯微鏡，特點(diǎn)是光源通過(guò)物鏡落射于樣品， 激發(fā)產(chǎn)生的熒光再通過(guò)物鏡進(jìn)入目鏡。 透射熒光顯微術(shù)光路:透射熒光顯微術(shù)是激 發(fā)光束通過(guò)聚光器自下而上的透射樣品，誘發(fā) 的熒光從物鏡前方進(jìn)入物鏡。汞燈發(fā)出的強(qiáng)光 經(jīng)集光透鏡、吸熱濾色鏡、鏡臂反光鏡、激發(fā) 濾色鏡、光路轉(zhuǎn)換反光鏡后光線(xiàn)轉(zhuǎn)射向上，進(jìn) 入視場(chǎng)光闌，暗視場(chǎng)聚光器，進(jìn)入樣品，激發(fā) 出的熒光射入物鏡經(jīng)阻斷濾色鏡進(jìn)入目鏡。 8 反射熒光顯微術(shù)的光路

7、:反射熒光又稱(chēng)落射 熒光，因激發(fā)光由物鏡后部進(jìn)入物鏡，向 下落射樣品，激發(fā)出熒光，熒光反射向上 再進(jìn)入物鏡。其光路如圖3-1和3-2所示。 汞燈發(fā)出高強(qiáng)的激發(fā)光，經(jīng)集光透鏡， 吸熱玻璃，孔徑光闌，激發(fā)濾色鏡，視場(chǎng) 光闌，通過(guò)二向色鏡，在此處一定波長(zhǎng)以 上的長(zhǎng)波光線(xiàn)透過(guò)二向色鏡，脫離光路， 一定波長(zhǎng)以下的短波光線(xiàn)反射向下進(jìn)入物 鏡，透過(guò)物鏡射向樣品，激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā) 出可見(jiàn)的熒光，熒光反射向上再次進(jìn)入物 鏡，復(fù)經(jīng)二向色鏡其中波長(zhǎng)較短的光線(xiàn)反 射至光源方向，熒光和長(zhǎng)波光線(xiàn)透射向上 經(jīng)阻斷濾色鏡進(jìn)入目鏡。 熒光顯微鏡的光學(xué)原理見(jiàn)圖3-3： 9 圖3-1落射熒光顯微鏡光路圖 10 圖3-2落射熒光顯微鏡

8、光路圖 11 圖3-3熒光顯微鏡的光學(xué)原理 12 熒光的種類(lèi) 自發(fā)熒光（固有熒光） 二次熒光 13 熒光顯微鏡的類(lèi)型 1、透射式熒光顯微鏡：激發(fā)光源是通過(guò)聚光 鏡穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光的。常用暗視 野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光 鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上這是比 較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí) 熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光 減弱所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好。 14 透射式熒光顯微鏡效果圖 15 透射式熒光顯微鏡光路圖 16 2落射式熒光顯微鏡 ：這是近代發(fā)展起來(lái)的新 式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下 落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器 和收集熒光的物鏡(

9、圖26)。光路中需加上一個(gè) 雙色束分離器，它與光鈾呈45角，激發(fā)光被反 射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒 光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā) 光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā) 光和熒光分開(kāi)，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。 如換用不同的激發(fā)濾片雙色束分離器阻斷濾 片的組合插塊，可滿(mǎn)足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。 此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清 晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng) 17 18 熒 光 顯 微 鏡 內(nèi) 部 構(gòu) 19 落射熒光顯微鏡光路圖落射熒光顯微鏡光路圖 20 使用方法 (1)高壓汞燈的調(diào)中：汞燈調(diào)中檢驗(yàn)器似物 鏡狀，使用時(shí)將其全部旋入物鏡轉(zhuǎn)換器， 中部有一

10、圓形屏，能映現(xiàn)汞燈的電弧像， 用以觀察調(diào)中。按通電源，按壓?jiǎn)?dòng)鈕， 點(diǎn)亮汞燈。完全開(kāi)放視場(chǎng)光闌和孔徑光闌。 轉(zhuǎn)動(dòng)汞燈室右側(cè)的水平和垂直調(diào)中螺旋， 通過(guò)調(diào)中器圓形屏觀察，至調(diào)中器內(nèi)部被 充分照明止。旋轉(zhuǎn)集光透鏡調(diào)焦鈕，使汞 燈電弧像聚焦，再用調(diào)中螺旋將電弧像驅(qū) 于水平對(duì)稱(chēng)位置（調(diào)中）。 21 (2)光吸收器的組裝： 反射式熒光裝置無(wú)需聚光器，由一底部 封閉的圓筒狀的光吸收器取代，用以吸收 射入的光線(xiàn)，防止四射。 組裝方法：降下聚光器架，將光吸收器 插入楔形神內(nèi)，固緊、回升最高位。 22 (3)操作程序 轉(zhuǎn)動(dòng)鏡臂旋轉(zhuǎn)臺(tái)，至相應(yīng)的標(biāo)志位。旋轉(zhuǎn)臺(tái)為 一圓盤(pán)狀結(jié)構(gòu)，上有5個(gè)定位標(biāo)志：U、V、B、G、 O

11、，分別代表不同的熒光激發(fā)方法及其不同的濾 色鏡系統(tǒng)組合。 點(diǎn)亮汞燈，接通電源，按壓?jiǎn)?dòng)器按鈕，使汞 燈點(diǎn)亮。 將鏡臂左側(cè)的DIA轉(zhuǎn)換鈕調(diào)至EPI位。 確認(rèn)汞燈點(diǎn)亮，照明系統(tǒng)正確，燈位調(diào)中，電 弧像聚焦準(zhǔn)確。 用熒光染料染色的樣品，放在載物臺(tái)上，用 10物鏡聚焦。 孔徑光闌的調(diào)整使用：光闌位于鏡臂中，用外 露手桿操縱。在汞燈調(diào)中、聚焦時(shí)，光闌應(yīng)全開(kāi)。 熒光顯微時(shí)，孔徑應(yīng)縮小，使之小于視場(chǎng)。 23 視場(chǎng)光闌的調(diào)整使用：視場(chǎng)光闌位于孔徑光闌 之后，亦由外露手桿操縱。視場(chǎng)光闌用于限定樣 品表面的照明區(qū)域，其開(kāi)度一般應(yīng)與孔徑光闌的 開(kāi)孔相當(dāng)。 輔助激發(fā)濾色鏡滑動(dòng)閥的使用:滑動(dòng)閥位于鏡臂 專(zhuān)用槽中，可拉出或推入。有三個(gè)擋位供不同使 用。全拉出位：供常規(guī)使用；中間位：用于激 發(fā)法，輔助濾色鏡進(jìn)入光路；全推入位：用作光 閥，阻斷全光線(xiàn) 激發(fā)方法：共有四種激發(fā)方法：紫外、紫、藍(lán) 和綠激發(fā)法，各適用于各種不同的熒光染色方法。 24