病毒的分離鑒定

1、病毒的分離與鑒定 要證明某種疾病是由某一感染性病毒所引起，則必須滿(mǎn)足以下原則： 從患病者體內(nèi)分離出病毒； 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或寄主細(xì)胞中可以培養(yǎng)； 證明這種培養(yǎng)物具有濾過(guò)性； 在原始宿主或相關(guān)種屬內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥； 能重新分離出病毒。 1. 病毒的分離 1.1 標(biāo)本的處理 1.1.1 標(biāo)本的收集 a) 糞便標(biāo)本：將5g糞便標(biāo)本和50ml PBS放入盛有20-25顆玻璃小 珠的100ml無(wú)菌瓶中，攪拌成懸液，倒出上清，3000X g, 4C離 心 6min 。 b) 拭子和生物體液：拭子浸在 2-3ml 運(yùn)載培養(yǎng)基中，將棉拭子中的 液體盡量擠出以獲得標(biāo)本，如果液體被污染，應(yīng)3000X g 4C離心 3

2、0min。 c) 組織標(biāo)本：用無(wú)菌乳缽或勻漿器研磨組織標(biāo)本，同時(shí)加入足量的 PBS制備成20%的懸液，3000X g 4C離心30min。 1.1.2 除菌處理 a）糞便可加青鏈霉素使最終濃度為10000單位/毫升，置4C過(guò)夜。 b）鼻咽拭子一般加抗生素最終濃度為 2000單位/毫升，置4C作用4 小時(shí)。 精選文庫(kù) C）對(duì)乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、腸道病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，則可加入等量的乙醚 4C過(guò)夜除菌。 1.2病毒的分離培養(yǎng) 病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。根據(jù) 病毒的不同選用敏感動(dòng)物（動(dòng)物接種）、雞胚（雞胚接種）或離體細(xì) 胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)）。

3、1.2.1雞胚接種 a) 雞卵的選擇：一般都選新鮮、10天以?xún)?nèi)的受精卵以保證規(guī)格質(zhì)量 上的一致。 b) 孵育：孵育時(shí)可將雞卵放入卵箱內(nèi)進(jìn)行，氣室向上，孵育的最適溫 度為38-39C，相對(duì)濕度為4070%，孵育8日后，雞卵應(yīng)每天 翻動(dòng)12次，以幫助雞胚發(fā)育勻稱(chēng)和防止雞胚膜粘連。 C） 檢卵：雞卵孵育45天后，即可用檢卵器檢查雞胚發(fā)育情況（二 天一次）。未受精雞卵：在檢卵器上僅見(jiàn)到模糊的陰影?；铍u 卵：雞胚發(fā)育4天后，在檢卵器上就可見(jiàn)到清晰的血管，雞卵內(nèi) 有一小黑點(diǎn)（雞胚），有明顯的自然轉(zhuǎn)動(dòng)。死胎：如果發(fā)現(xiàn)雞卵 血管模糊、擴(kuò)張、胚胎活動(dòng)呆滯或不能自主地轉(zhuǎn)動(dòng)，則可判斷胚 胎頻死或已經(jīng)死亡，應(yīng)將其挑撿

4、出來(lái) 雞胚孵育完畢后，用鉛筆 劃出氣室邊緣和胚胎的位置待用。 病毒的初次分離。 圖1.雞胚卵黃囊接種：用 58 天雞胚，以細(xì)長(zhǎng)針頭由雞卵氣室 圖刺入卵黃羊膜腔接種取獲卵黃12 囊膜檢查胚,常用于某些羊膜腔病 毒育分取羊水檢查。常用干流感 精選文庫(kù) 11 弗賈0 am m 1 e) 圖3.尿囊腔接種用912天雞 胚，將標(biāo)本接種于尿囊腔，孵育后 取尿囊液檢查，常用于培養(yǎng)流感 病毒和腮腺炎病毒等。 圖4.絨毛尿囊膜接種：用10l 2 天雞胚，以無(wú)菌手續(xù)在蛋殼上開(kāi) 小窗，然后將材料滴在絨毛尿 囊膜上.孵育后。觀察膜上有無(wú) 斑點(diǎn)病變。常用于培養(yǎng)單純皰疹 病毒、天花病毒和痘病毒。 剖檢及收獲 收獲前雞胚應(yīng)

5、置4C冰箱 過(guò)夜，使雞胚內(nèi)血液凝固。收獲 時(shí)，用碘酒將氣室部卵殼消毒, 將氣室處卵殼剝?nèi)ィú灰獙⑺槠淙霘つぃ?。然后用無(wú)菌手術(shù)刀柄從 胚胎背部輕輕下壓，（切勿壓破卵黃囊）再用吸管吸取尿囊液，置青 霉素小瓶?jī)?nèi)，于低溫保存。 f）優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡(jiǎn)單、來(lái)源充沛、價(jià)格低廉、數(shù)量可大、不需特殊設(shè) 備。缺點(diǎn)：很多病毒不能適應(yīng)，主要是哺乳動(dòng)物的病毒。 122細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動(dòng)物組織或 傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至24個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的 類(lèi)型和培養(yǎng)細(xì)胞代數(shù)的不同，可將其分為兩種：原代細(xì)胞培養(yǎng)；傳代 細(xì)胞培養(yǎng)。 組織細(xì)胞培養(yǎng)的病毒，當(dāng)出現(xiàn)穩(wěn)定

6、的細(xì)胞病變后，就可取培養(yǎng)液 或培養(yǎng)液與細(xì)胞培養(yǎng)物混和物，細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒可采用凍融、 超 聲波等方法使其釋放出來(lái)。 優(yōu)點(diǎn): a) 每個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對(duì)病毒易感性相等; b) 無(wú)個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好; C) 可嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作; d) 細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長(zhǎng)特征; e) 應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化。 2. 病毒的鑒定 2.1形態(tài)學(xué)鑒定 細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)：病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后, 可引起細(xì)胞的不同變化。常見(jiàn)的形態(tài)學(xué)改變?nèi)缂?xì)胞圓縮、聚合、溶解 或脫落。CPE出現(xiàn)的時(shí)間是鑒定病毒的標(biāo)志之一。 某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，在普

7、通光學(xué)顯微鏡 F可見(jiàn)胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不等的 圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，病毒學(xué)上稱(chēng)為包涵體。 2.2血吸附和血凝作用 多見(jiàn)于以出芽方式釋放的病毒。血吸附指感染細(xì)胞具有吸附紅細(xì) 胞的能力；血凝作用指感染細(xì)胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在， 具 有凝集紅細(xì)胞的作用。 221血吸附實(shí)驗(yàn) 具有血凝能力的病毒能使感染的細(xì)胞吸附紅細(xì)胞，這種現(xiàn)象被稱(chēng)作吸 附作用。大多數(shù)粘液病毒能引起吸附。具體檢驗(yàn)步驟如下: a) 用PBS配制10%的豚鼠紅細(xì)胞懸液，4C保存，用前按需要量稀 釋成0.5%的濃度（10%懸液1ml加19ml PBS混勻）。 b) 吸去對(duì)照和試驗(yàn)管培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，

8、試驗(yàn)管的上清液留待電鏡 觀察。 C） 每管加入0.2ml紅細(xì)胞懸液，4C孵育30min。用4C的PBS清洗 培養(yǎng)細(xì)胞3次。 d) 顯微鏡下讀取結(jié)果并記錄，根據(jù)吸附紅細(xì)胞的量可分為 0 （陰性） 4 （完全吸附）級(jí)。 e) 37C孵育60min,有神經(jīng)氨酸酶的病毒將會(huì)從紅細(xì)胞上游離下來(lái)。 2.2.2血凝實(shí)驗(yàn) a) 在血凝板第一排的112孔加入50 a l生理鹽水。 b) 在第1孔中加入50 a l病毒，混勻后吸50 a l到第2孑L,如此倍比 稀釋直到第10孔，混勻后棄50 a l;最后兩孔（11、12）為紅細(xì) 胞對(duì)照。 C) 將1%的紅細(xì)胞輕輕搖動(dòng)混勻，在112孔中每孔加入50 a l。 d)

9、 手工震蕩，37 C靜置30min （室溫40min）后觀察結(jié)果。 2.3電子顯微鏡檢查 病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進(jìn)行 檢查。對(duì)于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組 織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微 鏡檢查，直接觀察病毒粒子。 2.3.1正染法：超薄切片法 取材7固定（戊二醛/四氧化鋨）7清洗與脫水7浸透、包埋與聚合 7切片7染色（鈾染/鉛染） a）優(yōu)點(diǎn)：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過(guò)程。 b）缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，但標(biāo)本可長(zhǎng)時(shí)間保存。 2.3.2負(fù)染技術(shù) 負(fù)染是指通過(guò)重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外周的電 子密度，使樣品

10、顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。具體步驟 （漂浮法）為：現(xiàn)將需負(fù)染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上，再將有 支持膜的載網(wǎng)漂浮在樣品液滴上以沾取樣品， 用濾紙吸干樣品余液使 樣品在載網(wǎng)上僅有一薄層液膜，在樣品未干時(shí)即加一滴復(fù)染液的銅網(wǎng) 上，用濾紙吸干多余的染液即可。 a）優(yōu)點(diǎn)：快速簡(jiǎn)易（10-20min）;分辨率高；圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu)。 b）缺點(diǎn)：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有樣品應(yīng)處于懸浮 狀態(tài)。 2.4血清學(xué)試驗(yàn) 可采用ELISA、瓊脂擴(kuò)散、中和試驗(yàn)、標(biāo)記抗體技術(shù)等免疫血清 學(xué)方法檢查病畜的抗體消長(zhǎng)情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。 241中和反應(yīng) 利用病毒與特異性中和抗體結(jié)合的特性鑒定病毒的種類(lèi)，觀察特 異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動(dòng)物死亡，能否抑制病毒的細(xì)胞病變效 應(yīng)。 2