MTT實驗法測定細胞增殖1

1、mtt實驗法測定細胞增殖1.實驗材料 1.1. 實驗細胞株 癌細胞株用含有10%新生小牛滅活血清rpmi-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)在37、飽和濕度、5%co2的無菌培養(yǎng)箱中，每隔23天進行一次細胞傳代。 1.2 藥物與試劑 rpmi-1640 培養(yǎng)基 dmso 胰蛋白酶粉 1-甲基乙內(nèi)酰脲 5-氟尿嘧啶 mtt 粉 甘油 碘化丙啶(pi) 新生小牛血清 1.3 儀器設備 超凈工作臺（sw-cj-2fd 型） 超低溫電冰箱 恒溫水浴箱 低溫高速離心機 恒溫震蕩搖動床 -20電冰箱 光學顯微鏡 電子天平 eppendorf 移液槍（10、100、1000ul） 去離子純水儀 流式細胞儀 低溫數(shù)控高速離

2、心機 普通離心機 1.4 主要試劑配方 1.4.1 pbs 溶液 磷酸二氫鉀(kh2po4)0.24g、氯化鈉(nacl)8.0g、磷酸氫二鈉（na2hpo4）1.44g、氯化鉀(kcl)0.2g，用去離子水(ddh2o)溶解，然后將其定容使總體積為 1.0l。再使用鹽酸將 ph 值調(diào)至 7.4，用無菌鹽水瓶分裝好，高壓消毒滅菌，4內(nèi)保存。臨用前要在 37水浴加熱。 1.4.2 細胞培養(yǎng)基 稱取 ripm-1640 培養(yǎng)基粉 10.4g，用 1.0l ddh2o 溶解，再往溶液中加入 2g nahco3，再用鹽酸將 ph 值調(diào)整至 7.0，采用抽濾法除菌，無菌鹽水瓶分裝，置于 4冰箱中保存，使

3、用前往瓶中加入滅活新生小牛血清，使每瓶培養(yǎng)基中滅活新生小牛血清的濃度為 10%。每次臨用前要將含有 10%滅活新生小牛血清的rpmi-1640 培養(yǎng)基置于 37水浴箱中加熱。 1.4.3 新生小牛血清 臨用前，將新生小牛血清置于 56水浴中滅活 30min，之后用無菌鹽水瓶分裝密封，再置于-20冰箱中保存。 1.4.4 胰蛋白酶 在 100ml 的 pbs 溶液中加入胰蛋白酶粉 0.25g，置于 4冰箱中過夜，用直徑為 0.22m 微孔濾膜除菌器除菌后分裝、密封，置于 4冰箱中保存。 1.4.5 mtt 溶液(5mg/ml) 往 50ml 無菌 pbs 中加入 250mg mtt 粉，輕輕搖勻

4、，使 mtt 粉充分溶解，予用直徑為 0.22m 微孔濾膜除菌后分裝、密封，錫箔紙避光，置于 4冰箱中臨時保存（7 天），置于-20冰箱中短期保存（1 月）。 1.4.6 4%多聚甲醛 稱取多聚甲醛 4g 溶于 50ml 蒸餾水中，然后加熱至 70左右，用玻璃棒攪拌溶液使多聚甲醛充分溶解，然后往溶液中逐滴加入濃度為 1mol/l 的 na0h 至溶液澄清，冷卻，蒸餾水定容至 100ml，用鹽酸將 ph 調(diào)至 7.2，錫箔紙避光，置于 4冰箱中保存。 1.4.7 蘇木精染液 蒸餾水 700ml，甘油 300ml，蘇木精 5g，碘酸鈉 0.5g，冰醋酸 20ml，硫酸鋁鉀 500g。 1.4.8

5、伊紅染液 蒸餾水 100ml，伊紅 0.5g，氯化鈣 0.5g。 1.4.9 1-甲基乙內(nèi)酰脲溶液的配制 1-甲基乙內(nèi)酰脲（m）分子式為 c4h6n2o2，分子量為 114.10，純度99.0%，吸取適量該藥物，加入少量 pbs 或生理鹽水（ph7.4），配制成 500 mgl-1的母液。-20保存，臨用時稀釋。 1.4.10 5-fu 溶液的配制 5- 氟尿嘧啶（ 5-fu ）分子量為 130.08 ，分子式為 c4h3fn2o2，規(guī)格為250mg/10ml，ph 值為 8.49.2，吸取適量該藥物，加入少量 pbs 或生理鹽水（ph7.4），配置成 100mgl的母液。-20保存，臨用時稀

6、釋。 2.實驗方法. 2.1.細胞培養(yǎng)2.1.1.細胞復蘇 (1)從-80冰箱迅速取出凍存人結腸癌 sw480 細胞的凍存管，然后迅速投入37水浴箱中，輕輕搖動凍存管，使凍存管內(nèi)容物迅速融化，取出后用 75%酒精消毒，放入無菌操作臺，在操作臺中開啟凍存管。用 1000ul 的移液槍吸出溶解的細胞懸液，注入離心管，同時往離心管中加入 10 倍 10%滅活新生小牛血清rpmi-1640 培養(yǎng)基，準備離心。 (2) 室溫下，1000 rpm，離心 5min，用移液槍吸取離心管中上清液、棄去，然后用細胞培養(yǎng)液洗 12 次，棄去上清培養(yǎng)液后，加入 1ml 培養(yǎng)液，用吹打管輕輕吹打，使離心管底部的細胞懸于

7、培養(yǎng)基中，形成懸浮液。 (3)用培養(yǎng)液適當稀釋懸浮液后，用移液槍將細胞懸液接種到 100ml 的無菌培養(yǎng)瓶，蓋好瓶蓋，將接種有人結腸癌 sw480 細胞的培養(yǎng)瓶放入飽和濕度、5%co2、溫度為 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h 后更換培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞的生長狀況，待細胞生長狀態(tài)基本恢復正常后，取對數(shù)期細胞進行實驗。 2.1.2.細胞傳代 (1) 在普通光學顯微鏡下觀察觀察細胞的生長狀況，當細胞在培養(yǎng)瓶貼壁面生長融合達 70%80%時，棄去培養(yǎng)液，然后用 pbs 液洗 12 遍。(2) (2)用 0.25%胰酶細胞消化液，于室溫或 37下消化鐵壁細胞數(shù)分鐘，邊消化邊在顯微鏡下觀察細胞

8、的形態(tài)變化，當 70%細胞的胞膜發(fā)生皺縮，細胞體積變小、細胞變圓時，往培養(yǎng)瓶中加入 10%滅活新生小牛血清的 rpmi-1640 培養(yǎng)基45ml，終止消化。 (3)用彎頭吸管反復吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液吹打培養(yǎng)瓶的細胞貼壁生長面，吹打時確保培養(yǎng)瓶底部各個部位都要吹打到，動作輕柔，幅度不要太大，使貼壁細胞脫落形成細胞懸液。 (4)按實驗所需細胞濃度接種，分成 23 個培養(yǎng)瓶，置于飽和濕度、5%co2、溫度為 37培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 2.1.3.細胞收集 (1) 在室溫或 37下，用 0.25%胰酶消化液消化貼壁細胞，制成細胞懸液。 (2)用移液槍將培養(yǎng)瓶中細胞懸液移入 10ml 離心管，常溫下 1000r

9、pm，離心5min，棄去上清液，再加入 5ml pbs 洗滌 23 次。 2.1.4.細胞計數(shù) (1) 在室溫或者 37下，用胰酶消化液消化貼壁細胞，制成細胞懸液。 (2)取蓋玻片、計數(shù)載玻片各一塊，先用 pbs 清洗干凈，再用 75%酒精反復擦拭計數(shù)載玻片和蓋玻片，然后風干，蓋上蓋玻片，用 10ul 移液槍吸取細胞懸液 5l 由蓋玻片一側緩慢的滴入計數(shù)載玻片中，使載玻片和蓋玻片之間均勻的充滿細胞懸液體。 (3)在用 10物鏡顯微鏡下，觀察計數(shù)載玻片上四角計數(shù)格內(nèi)所含細胞的總數(shù)x。計數(shù)原則：細胞壓中線時，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，細胞團塊合計為一個細胞。 (4)將計數(shù)所得細胞總數(shù)代入公式，得出細

10、胞密度x/4104個/ml（細胞數(shù)/毫升原液）。 2.1.5.細胞凍存 (1)選擇對數(shù)期生長的細胞凍存，用濃度為 0.25%胰蛋白酶消化液把培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞消化下來，把已經(jīng)消化好的細胞根據(jù)細胞傳代的方法收集起來，同時細胞計算，之后將收集的細胞加到離心管，1000rpm，離心 5min，去上清液。 (2)往離心管中加入凍存液，將細胞密度調(diào)整為(510)106個/ml。凍存液的配制：甘油、胎牛血清按體積比 1:9 的比例均勻混合。 (3) 將離心管中含有細胞的凍存液分裝到凍存管，每個凍存管加 11.5ml含細胞液， 在 4冰箱中放置 30 分鐘，轉(zhuǎn)入-20的冰箱中放置 2h 后，再放入-80冰箱

11、 24h，最后轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。 2.2 mtt 比色法檢測 1-甲基乙內(nèi)酰脲、5-fu 及兩者聯(lián)合對 sw480 細胞增值的抑制作用 2.2.1 實驗分組：分為四大組：對照組（等量pbs）、1-甲基乙內(nèi)酰脲組(m)、5-fu-、 甲基乙內(nèi)酰脲與5-氟尿嘧啶聯(lián)合組(mfu)。 2.2.2 1-甲基乙內(nèi)酰脲對 sw480 細胞的增值抑制作用 根據(jù)文獻數(shù)據(jù)和預實驗，將 1-甲基乙內(nèi)酰脲組設八個濃度組：m0.5mgl-1、m5mgl-1、m10mgl-1、m20mgl-1、m50mgl-1、m100mgl-1、m200mgl-1、m500mgl-1。各組分別干預人結腸癌 sw480 細胞 24、48

12、、72h，mtt 法檢測1-甲基乙內(nèi)酰脲對 sw480 細胞增殖抑制作用。 以上實驗各組設置 6 個平行孔，實驗重復三次，分析比較各組細胞增殖抑制率有無統(tǒng)計學差異。2.2.3 檢測 1-甲基乙內(nèi)酰脲及 5-fu 分別對 sw480 細胞增殖的抑制作用 根據(jù)文獻數(shù)據(jù)和上述實驗結果，將 1-甲基乙內(nèi)酰脲和 5-fu 各設四個濃度組。1-甲基乙內(nèi)酰脲為 m 10mgl-1、m20 mgl-1、m50mgl-1、m100mgl-1四個濃度，5-fu 為 fu 10mgl-1、fu20mgl-1、fu50mgl-1、fu100mgl-1四個濃度。1-甲基乙內(nèi)酰脲和 5-fu 各設的四個濃度組藥物濃度相同

13、，有利于兩者效果比較分析。根據(jù)文獻數(shù)據(jù)和上述實驗結果，選擇各組藥物干預 48 小時后，進行 mtt 法檢測 1-甲基乙內(nèi)酰脲、5-fu 對 sw480 細胞增殖抑制作用。 以上實驗分組中各組設置 6 個平行孔，實驗重復三次，分析比較各組細胞增殖抑制率有無統(tǒng)計學差異。 2.2.4 檢測 1-甲基乙內(nèi)酰脲與 5-fu 聯(lián)合應用對 sw480 細胞增殖的抑制作用 1-甲基乙內(nèi)酰脲與 5-fu 聯(lián)合用藥設四個組：m10mgl-1fu10mgl-1、m 20mgl-1fu 20mgl-1、m50mgl-1fu50mgl-1、m100mgl-1fu100mgl-1。各組分別干預人結腸癌 sw480 細胞

14、48h 后，mtt 法檢測各組對 sw480 細胞增殖的抑制作用，并與單獨應用 5-fu 作用效果進行比較。以上實驗分組中各組設置 6 個平行孔，實驗重復三次，分析比較各組對細胞增殖抑制率的影響，差異有無顯著性。2.2.5 mtt比色法基本原理噻唑藍(mtt)比色實驗是實驗研究中用來檢測細胞生長、存活的方法之一。mtt的基本原理為在活細胞線粒體中外源性的mtt能夠被細胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原為一種紫藍色且難溶于水的結晶物甲瓚，甲瓚沉積在細胞胞質(zhì)中，但是死亡細胞不會出現(xiàn)此現(xiàn)象。當甲瓚遇到二甲基亞砜(mdso)時，沉積在細胞中的甲瓚會被mdso溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm或570nm的波長處

15、測定甲瓚光密度值(od值)，用來間接反映活細胞的數(shù)量。形成mtt結晶物的量與活細胞的數(shù)量成正相關。 2.2.6 實驗操作步驟 (1) 接種細胞：用 0.25%胰蛋白酶消化液消化貼壁的單層培養(yǎng)細胞，用含 10%新生小牛血清 rpmi-1640 培養(yǎng)液配制成單個細胞懸液，調(diào)細胞懸液內(nèi)細胞的濃度，使細胞懸液濃度為 3104個/ml，再將細胞懸液接種細胞于 96 孔培養(yǎng)板中，一次接種 3 個培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板每孔加入上述細胞懸液 180l，每孔細胞 5200個。(2) 培養(yǎng)細胞：將接種好的培養(yǎng)板置入飽和濕度、37、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4h，待細胞貼壁后，用移液槍輕輕吸取培養(yǎng)板中的上清液、棄去。 (3)各組的藥物干預： 按照實驗方案，各組藥物按方案濃度加入已接種 sw480 細胞的培養(yǎng)板中。于 37、5%co2、飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 (4)呈色：分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到研究方案確定的時間后，往 96 孔板每孔中加入 20l 5 mgl-1 mtt 溶液，繼續(xù)置于 37、5%