蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)

1、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),1,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),2,一、免疫學(xué),研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能； 免疫應(yīng)答產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能； 抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的規(guī)律。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),3,免疫學(xué)的研究范圍很廣，與很多相關(guān)學(xué)科交織在一起，并且發(fā)展成了很多學(xué)科，如免疫生物學(xué)、免疫遺傳學(xué)、血液免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)等。 隨著免疫生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在高等動(dòng)物體內(nèi)存在著具有免疫功能的組織結(jié)構(gòu)（即免疫系統(tǒng)）。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),4,淋巴組織,免疫活性細(xì)胞,免疫活性介質(zhì),蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),5,免疫系統(tǒng)功能的生理和病理表現(xiàn),功能名稱 生理功能 病理表現(xiàn),免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性異物 超敏

2、反應(yīng)（強(qiáng)） 免疫缺陷?。ㄈ酰?免疫自穩(wěn) 清除損傷或衰老細(xì)胞 自身免疫性疾病 免疫監(jiān)視 清除突變或畸變細(xì)胞 防止腫瘤發(fā)生 腫瘤或病毒持續(xù)性 殺傷病毒感染細(xì)胞 感染,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),6,當(dāng)外源異體物質(zhì)，如細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)、多糖等進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生對(duì)外源物質(zhì)的排除作用，從而保護(hù)機(jī)體免受外源物質(zhì)的侵害。 機(jī)體的這一特異免疫應(yīng)答功能的細(xì)胞基礎(chǔ)是淋巴細(xì)胞。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),7,免疫應(yīng)答的類型 （一）固有性免疫應(yīng)答（innate immune response) 又稱先天性免疫應(yīng)答，非特異性免疫應(yīng)答：是機(jī)體在種系發(fā)育和進(jìn)化過(guò)程中形成的免疫防御功能。 （二）適應(yīng)性免疫應(yīng)答（a

3、daptive immune response） 又稱獲得性免疫應(yīng)答，特異性免疫應(yīng)答，是機(jī)體出生后通過(guò)與抗原物質(zhì)接觸后所產(chǎn)生的一系列防御功能。（具有特異性、多樣性、記憶性、耐受性、自限性）,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),8,抗原和免疫原性,抗原（antigens，Ag）是指能夠刺激機(jī)體免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。 常見(jiàn)的抗原有蛋白質(zhì)、多糖、磷脂、脂多糖、結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸、激素等有機(jī)物。 抗原具有兩方面的特性：免疫原性（immunogenicity）和免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）。 免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激機(jī)體引起免

4、疫應(yīng)答的能力。 免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）是指抗原與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物(即抗體)在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的能力。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),9,抗原的分類,抗原可以分為完全抗原和半抗原。 完全抗原：具有免疫原性和免疫反應(yīng)性的抗原稱為完全抗原（complete antigen） 半抗原：只具有免疫反應(yīng)性而無(wú)免疫原性的抗原稱為半抗原（hapten），也稱為不完全抗原(incomplete antigen)。與蛋白質(zhì)結(jié)合后成為完全抗原。半抗原能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。絕大多數(shù)多糖和所有類脂都屬于半抗原。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),10,抗體的種類,抗體（antibo

5、dies，Ab)是專門對(duì)抗抗原特異結(jié)構(gòu)的球蛋白，故也稱為免疫球蛋白（immunoglobulins, Ig)。存在于血清、體液中，是構(gòu)成機(jī)體免疫作用的主要物質(zhì)。 免疫球蛋白依據(jù)其理化性質(zhì)及生化性質(zhì)的不同，分為五種類型： IgG、 IgA、 IgM、 IgD和IgE。 人體血清中IgG含量最多， IgA次之， IgM較少， IgD和IgE微量。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),11,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),12,抗原抗體反應(yīng)（antigen-antibody reaction） 是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi)（in vivo），也可發(fā)生于體外（in vitro）。 體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬

6、、溶菌、殺菌、中和毒素等作用； 體外反應(yīng)：可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。 因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測(cè)中多采用血清作試驗(yàn)，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學(xué)反應(yīng)（serologic reaction）。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),13,二、印跡法（blotting）,印跡法是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。 1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern 印跡法。 人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，

7、對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),14,三、蛋白免疫印跡的應(yīng)用,免疫印跡法 (immunoblotting test,IBT)，亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB 是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。 具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。 是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),15,蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)技術(shù)

8、,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理 三、實(shí)驗(yàn)儀器 四、操作步驟 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 六、思考題,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),16,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)掌握動(dòng)物抗血清的制備原理及技術(shù) 通過(guò)實(shí)際操作學(xué)會(huì)動(dòng)物抗血清的制備 掌握Westernblotting的基本原理 熟悉Westernblotting的實(shí)驗(yàn)操作,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),17,二、實(shí)驗(yàn)原理,第一部分 動(dòng)物的常規(guī)免疫及抗血清的制備 第二部分 Westernblotting 檢測(cè)抗血清,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),18,將適當(dāng)?shù)目乖镔|(zhì)注入動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，動(dòng)物血清中可出現(xiàn)大量特異性抗體，這種含抗體的血清稱為免疫血清。 優(yōu)質(zhì)免疫血清的產(chǎn)生，主要取決于抗原的純度

9、和免疫原性，以及動(dòng)物應(yīng)答的能力。此外，尚需考慮免疫途徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時(shí)間間隔、有無(wú)佐劑等因素。,第一部分 動(dòng)物的常規(guī)免疫及抗血清的制備,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),19,（一）多克隆抗體的概念,抗原通常是由多個(gè)抗原決定簇組成的。 由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（Monoclone antibody）。 由多個(gè)抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體。 機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),20,抗體的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),21,（二）用于免疫的動(dòng)物,由于動(dòng)物的遺傳性不同，

10、同一抗原對(duì)不同動(dòng)物或同種不同品系動(dòng)物、或不同個(gè)體，產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱是不同的。因此，進(jìn)行動(dòng)物免疫時(shí)，必須選擇對(duì)該抗原敏感的、年輕的健康動(dòng)物。 常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般為6個(gè)月大小的動(dòng)物。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),22,動(dòng)物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量。 如要獲得大量的抗體，多采用大動(dòng)物； 如要是獲得直接標(biāo)記診斷的抗體，則直接采用本動(dòng)物； 如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動(dòng)物制備抗體； 如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備。 一般實(shí)驗(yàn)室采用的抗體，多用兔和羊制備，因動(dòng)物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清。,蛋白質(zhì)免疫

11、印跡技術(shù),23,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),24,（三）抗原,抗原是多種多樣的，就其化學(xué)成分而言，有蛋白質(zhì)抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等。 為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原。 不同的抗原，其免疫原性的強(qiáng)弱均不相同，這種免疫原性的強(qiáng)弱取決于抗原的分子量、化學(xué)活性基團(tuán)、立體結(jié)構(gòu)等。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),25,（四）免疫途徑,免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等。 一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1mL左右。 實(shí)驗(yàn)中0.2mL，34點(diǎn)注射。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),26,皮下注射,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),27,（五）佐劑,應(yīng)用佐劑的目的是為了提高抗原

12、對(duì)機(jī)體的免疫原性，從而提高抗體的效價(jià)。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),28,佐劑主要可分為兩種：一種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌（結(jié)核分枝桿菌）以及革蘭陰性桿菌等；另一種本身無(wú)免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。 目前實(shí)踐中常應(yīng)用的佐劑福氏佐劑。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),29,福氏佐劑（Freundadjuvant）, 通常是由羊毛脂1份、石臘油5份。這是不完全福氏佐劑。 在每毫升不完全佐劑加入120mg卡介苗就成為完全佐劑。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),30,（六）免疫方法,抗原劑量，首次劑量為1050g，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量的1/4。 首次免疫時(shí)抗原與完全佐劑等體積混合。加

13、強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑。 每23周加強(qiáng)免疫一次。 在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取23mL血，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),31,抗體的產(chǎn)生順序與豐度,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),32,（七）抗血清的采集與保存,取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈放血，也可心臟采血。 小鼠取血。 收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4下，過(guò)夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝（0.050.2mL），貯于-80以下冰箱，或凍干后貯存于4

14、冰箱保存。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),33,（八）抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià),在免疫期間，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作徹底的評(píng)價(jià)后，才可使用所取得的抗血清。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),34,效價(jià)抗血清的效價(jià)，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測(cè)定的方法常用的是單向擴(kuò)散免疫法，此法對(duì)所有的抗體均適用。 某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測(cè)定。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),35,單向擴(kuò)射免疫法：以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測(cè)定其結(jié)合率。通常以結(jié)合

15、率為50%的血清稀度和為效價(jià)。 如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1：15000,則該血清的效價(jià)就是1：15000 制備含有一定濃度抗血清的瓊脂凝膠板（抗體固定不變）。打孔，加入不同稀釋度的抗原量，進(jìn)行免疫擴(kuò)散。抗原與相應(yīng)抗體在濃度合適時(shí)，則形成清晰的沉淀環(huán)，其直徑大小與所加抗原量成正比。將已知參考抗原形成的沉淀環(huán)繪成曲線，然后以待測(cè)標(biāo)本的沉淀環(huán)直徑查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),36,雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。,雙向免疫擴(kuò)散,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),37,免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 1抗原；27

16、為不同稀釋倍數(shù)的抗體,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),38,分 子 雜 交 原 理 及 流 程 圖,樣 品 制 備,電 泳,雜 交,轉(zhuǎn) 膜,結(jié)果顯示,探 針 制 備,第二部分 Westernblotting 檢測(cè)抗血清,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),39,Western Blot原理,將通過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上； 然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)； 洗滌去除沒(méi)有結(jié)合的特異性抗體后； 加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體； 加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無(wú)特異性蛋白條帶的出現(xiàn)。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),40,蛋白

17、質(zhì)免疫印跡技術(shù),41,免疫印跡的實(shí)驗(yàn)包括五個(gè)步驟： 固定：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。 封閉：保持膜上沒(méi)有抗體的結(jié)合場(chǎng)所，使場(chǎng)所處于飽和狀態(tài)，用以避免特殊性抗體單獨(dú)結(jié)合到膜上。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),42,一抗雜交：初級(jí)抗體（第一抗體）是特異性的。 二抗雜交：第二抗體或配體試劑對(duì)于初級(jí)抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。 底物顯色：被適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見(jiàn)的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),43,三、實(shí)驗(yàn)儀器,動(dòng)物的常規(guī)免疫 Westernblotting 檢測(cè)抗血清,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),44,動(dòng)物的常規(guī)免疫,注射器 蝸旋混合器,蛋

18、白質(zhì)免疫印跡技術(shù),45,四、操作步驟,動(dòng)物的常規(guī)免疫 Westernblotting 檢測(cè)抗血清,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),46,抗原的提取與制備 1）0.5mg/mL菠蘿蛋白酶以0.9%生理鹽水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五上）。 2）純化的雞卵類粘蛋白（周四上午）。 3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理鹽水溶解配置（加少量NaOH促溶） （周四下午）。,動(dòng)物的常規(guī)免疫,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),47,苦味酸（以75%乙醇配置）標(biāo)記小鼠,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),48,初級(jí)免疫：小鼠背部多點(diǎn)皮下注射，0.2mL/只小鼠 （1）抗原與佐劑的混合：取1.5mL蛋白與1.5mL完全佐劑混合，震蕩混勻，

19、制成油包水的形態(tài) （2）用酒精棉球消毒待注射部位 （3）皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量應(yīng)小于0.1mL 初級(jí)免疫后仔細(xì)觀察小鼠對(duì)外源抗原的反應(yīng)，兩周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),49,加強(qiáng)免疫：初級(jí)免疫后兩周進(jìn)行。 取1.5mL蛋白與1.5mL不完全佐劑混合震蕩混勻，制成油包水的形態(tài)。 加強(qiáng)免疫：小鼠背部多點(diǎn)皮下注射，0.15mL/只小鼠 （1）用酒精棉球消毒待注射部位 （2）皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量應(yīng)小于0.1mL。 第二次加強(qiáng)免疫：加強(qiáng)免疫一周后進(jìn)行。操作相同。 第二次加強(qiáng)免疫后一周，即可采血，收集抗血清。 小鼠取血。收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4下，析出血清，離心，3000rpm,10min。吸出血清，分裝（0.050.2mL），貯于-20以下冰箱保存。,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),50,Western Blot一般流程,蛋白樣品的制備 SDSPAGE,轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗雜交 二抗雜交 底物顯色,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),51,轉(zhuǎn)移電泳設(shè)備,Westernblotting 檢測(cè)抗血清,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),52,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),53,蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),54,轉(zhuǎn)膜,半干法 將凝