TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和方法

1、tunel法檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和方法細(xì)胞凋亡中染色體dna的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程，染色體dna首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 的染色體dna在ca 和mg 依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180200bp核小體dna多聚體。 dna雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列dna的3-oh末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（tdt）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到dna的3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記

2、法（tunel）。 由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有dna的斷裂，因而沒有3-oh形成，很少能夠被染色。低分子量的dna分離后，也可使用dna聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的dna標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。 tunel或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采

3、用。 一、過氧化物酶標(biāo)記測定法 原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛（digoxigenin）-11-dutp在tdt酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈dna的3-oh末端，與datp形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。 毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低?？沟馗咝恋奶禺愋钥贵w與脊椎動物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1，若此抗體的fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排

4、除細(xì)胞fc受體非特異性的吸附作用。 本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測定。 (一)試劑配制 1、磷酸緩沖液pbs（ph7.4）：磷酸鈉鹽 50mm，nacl 200mm。 2、蛋白酶k（200g/ml，ph7.4）：蛋白酶k 0.02g；pbs 100ml。 3、含2%h2o2的pbs緩沖液（ph7.4）：h2o2 2.0ml；pbs緩沖液 98.0ml。 4、tdt酶緩沖液（新鮮配）：trlzma堿 3.63g用 0.1n hcl調(diào)節(jié)ph至 7.2，加ddh2o定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 2996g和氯化鈷0.238g。 5、

5、tdt酶反應(yīng)液：tdt酶32l；tdt酶緩沖液 76l，混勻，置于冰上備用。 6、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddh2o 1000ml 7、0.05二氨基聯(lián)苯（dab）溶液：dab 5mg；pbs 10ml，ph7.4, 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。 8、0.5甲基綠（ph4.0）：甲基綠0.5g；0.1m乙酸鈉100ml。 9、100丁醇，100、95、90、80和70乙醇，二甲苯，10中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。 10、過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（oncor） （二）實(shí)驗(yàn)步驟 1、標(biāo)本預(yù)處理： （1）石蠟包埋的組織切片預(yù)處理：將組織切片置

6、于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95和75乙醇各洗一次，每次3min。用pbs洗5min 加入蛋白酶k溶液（20ugml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。 （2）冰凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用pbs洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20處理5min，去除多余液體。用pbs洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。 （3）培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：將約 5 107個(gè)/ml細(xì)胞于 4中性甲醛室溫

7、中固定 10min。在載玻片上滴加 50100l細(xì)胞懸液并使之干燥。用pbs洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。 2、色缸中加入含2過氧化氫的pbs，于室溫反應(yīng)5min。用pbs洗兩次，每次5min。 3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 tdt酶緩沖液，置室溫15min。 4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54l tdt酶反應(yīng)液，置濕盒中于37c反應(yīng) 1hr（注意：陰性染色對照，加不含tdt酶的反應(yīng)液）。 5、將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。 6、 組織切片用pbs洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30min。 7、用pbs洗4次，每次5min。 8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05dab溶液，室溫顯色36min。 9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。 10、 于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100正丁醇洗三次。 11、 用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡