MTT法檢測細(xì)胞活性及其應(yīng)用

1、MTT法檢測細(xì)胞活性及其應(yīng)用一、實驗?zāi)康?.掌握MTT法的基本原理和操作，學(xué)會應(yīng)用MTT法解決簡單的實際問題。2.鞏固動物細(xì)胞培養(yǎng)的知識，熟練相關(guān)操作。3.學(xué)會酶聯(lián)免疫檢測儀（簡稱酶標(biāo)儀）的操作方法。二、實驗原理1.MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）三聯(lián)溶液能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣

2、泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。2.細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。3.從動物機(jī)體中取出的相關(guān)組織通過胰蛋白酶或膠原蛋白酶可以將其分散成單個細(xì)胞。再放于

3、適宜的培養(yǎng)基中，可以使這些細(xì)胞生長繁殖以供實驗所需。該實驗對無菌要求極高，以培養(yǎng)出滿足實驗條件的細(xì)胞。4.酶聯(lián)免疫檢測儀測定的原理是在特定波長下檢測被測物的吸光值。酶標(biāo)儀實質(zhì)就是一臺變相的專用光電比色計或分光光度計。三、實驗材料，器材與試劑材料：Hela細(xì)胞器材：恒溫水浴鍋，超凈工作臺，培養(yǎng)箱（37，5%CO2），冰箱（4、-20、-70），液氮冰箱，滅菌鍋，燒杯，培養(yǎng)瓶，滴管，酒精燈，鑷子，離心機(jī)，24孔培養(yǎng)板，96孔培養(yǎng)板，搖床，酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡，移液槍（帶槍頭），15mL離心管,凍存管（1-2mL），紅血球計數(shù)板，記號筆，0.22m濾膜，鋁箔紙。試劑：二甲基亞砜（分析純），甘油，10%

4、胎牛血清，胰蛋白酶（0.5%），雙抗（青霉素，鏈霉素 1萬單位/mL）,磷酸緩沖液（配制見附錄1），MTT（ 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。）（配制見附錄2），DMEM培養(yǎng)液(配制見附錄3)，無菌水，抗腫瘤藥物（具體待定）4、 實驗步驟A.Hela細(xì)胞復(fù)蘇 1.從液氮容器中取出從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37溫水中，并不時搖動令其盡快融化； 2. 從37水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上DEME培養(yǎng)液，混勻； 3. 離心，1000rpm，5min； 4. 棄去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸

5、細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1104個/mL，部分接種培養(yǎng)瓶，37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)； 5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，此后定期更換培養(yǎng)液，維持細(xì)胞正?；钚?。B.MTT檢測復(fù)蘇細(xì)胞的細(xì)胞活性 Hela細(xì)胞計數(shù)用血細(xì)胞計數(shù)板的四個角上的方塊。 1. 接種培養(yǎng)瓶同時，將其余部分接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，7組，每組5孔，每孔100L,37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)； 2.培養(yǎng)24h后，向每孔內(nèi)加入用磷酸緩沖液配制的0.5%MTT（5mg/mL）20uL，37培養(yǎng)箱內(nèi)培育； 3.4h后終止培養(yǎng)，將孔內(nèi)培養(yǎng)液小心吸出。每孔加入150L二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。同時每行第一孔設(shè)置為調(diào)零孔（

6、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）。用酶標(biāo)儀OD570nm處測量各孔吸光值；C.細(xì)胞生長曲線制作 接B.2，B.3步驟，連續(xù)測量7天，根據(jù)測量結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線。 橫坐標(biāo)生長時間，縱坐標(biāo)吸光度值。D.探究某藥物對于細(xì)胞活性的影響 1.將之前培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用0.5%胰蛋白酶洗脫，加入DEME培養(yǎng)液制成細(xì)胞密度為1106個/mL的細(xì)胞懸液； 2.設(shè)置空白對照組及5個不同藥物梯度的實驗組，分別加載96孔培養(yǎng)板內(nèi)（5個梯度劑量按藥物種類待定），每個劑量分別設(shè)置5個平行孔，每孔加入細(xì)胞懸液100L（在加藥的前一天下午完成鋪板）； 3.次日上午按預(yù)先設(shè)置的藥物梯度加藥，后置37培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h； 4.每

7、孔加入20LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h（若藥物能與MTT反應(yīng)，可以先離心后棄去上清液，用PBS沖洗2-3遍后再加入MTT溶液） 5終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液； 6.每孔加入150L二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀OD490nm處測量各孔的吸光度； 7.同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。E.Hela細(xì)胞凍存 1.配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液； 2.取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中； 3

8、.離心1000rpm，5min； 4.去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5106/ml1107/ml； 5.將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管11.5 ml； 6.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者； 7.凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1-2/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25以下時，可增至-5-10/min；到-100時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。五、實驗結(jié)果 Hela細(xì)胞復(fù)蘇情況良好，生長曲線繪制較好，成功驗證腫瘤細(xì)胞對Hela細(xì)胞的作用。六、附錄1.磷酸緩沖液配制方法 NaCl 8g,