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1、鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1 的生物學(xué)特性及體內(nèi)具抗菌活性噬菌體篩選方法的建立細(xì)菌對(duì)抗菌藥物耐藥性的不斷加劇嚴(yán)重威脅著公眾健康, 這是全世界共同關(guān)注的重大問(wèn)題。尤其是鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌以及銅綠假單胞菌, 對(duì)所有常規(guī)使用抗生素全耐藥菌株的出現(xiàn), 使臨床醫(yī)生處于無(wú)藥可選的困境。更為嚴(yán)峻的是 , 目前處于臨床試驗(yàn)階段的新抗菌藥物種類非常有限, 其中大多數(shù)仍是對(duì)傳統(tǒng)藥物的結(jié)構(gòu)修飾物。新型抗生素的研發(fā)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于細(xì)菌耐藥性的變異。人們意識(shí)到 , 抗生素治療細(xì)菌感染的時(shí)代已接近終點(diǎn), 尋找新的治療手段勢(shì)在必行。噬菌體以其殺菌特異性強(qiáng), 、自然資源豐富、無(wú)毒無(wú)害以及易于生產(chǎn)和工程改造等優(yōu)點(diǎn) , 為人類開(kāi)發(fā)
2、新型抗菌藥物提供有效手段。然而 , 用噬菌體防治細(xì)菌感染就必須先從環(huán)境中分離篩選到能高效殺滅各種致病菌的噬菌體 , 并對(duì)這些噬菌體的生物學(xué)特性進(jìn)行研究, 這是決定噬菌體治療成敗的基礎(chǔ)和前提。鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌, 因其耐藥性日趨嚴(yán)重 , 甚至已出現(xiàn)“全耐藥”菌株而受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體的研究卻非常有限。本文采用鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株為宿主菌, 從環(huán)境中成功分離到一株全新的能夠高效裂解此菌的噬菌體 , 命名為 ZZl 。本文目的是研究噬菌體ZZ1 的生物學(xué)特性 , 包括基因組測(cè)序和全基因組生物信息學(xué)的分析。同時(shí) , 通過(guò)觀察尾靜脈注射ZZ1 對(duì)
3、全身感染小鼠的治療效果來(lái)評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。本文為采用噬菌體制劑防治細(xì)菌感染奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法 1 鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體 ZZ1 的分離及其生物學(xué)特性的研究采集污水樣品, 以鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株為指示菌分離噬菌體;挑取單個(gè)透明噬菌斑, 進(jìn)行多次單斑分離以純化噬菌體;采用液體增殖和平板固體增殖的方法增殖噬菌體ZZ1;采用 PEG8000共沉淀、氯仿抽提的方法濃縮噬菌體ZZ1 顆粒;采用氯化銫密度梯度離心法純化噬菌體 ZZ1 顆粒;透射電鏡觀察噬菌體ZZ1形態(tài);通過(guò)雙層平板法測(cè)定噬菌體ZZ1效價(jià) , 調(diào)查噬菌體 ZZ1 的噬菌譜 , 并用通用引物擴(kuò)增16s rRNA,測(cè)序后進(jìn)行 Blastn比對(duì)
4、鑒定其宿主種類 , 繪制噬菌體 ZZ1 的一步生長(zhǎng)曲線 , 檢測(cè)噬菌體 ZZ1 對(duì)溫度、pH等理化因素的穩(wěn)定性 , 測(cè)定噬菌體 ZZ1 殺滅其宿主菌的最佳溫度范圍。采用 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取噬菌體 ZZ1基因組;用DNase(RNase Free), RNase A (DNase Free)和 Hind 的酶解作用鑒定基因組類型;用 Covaris S220 將噬菌體 ZZ1DNA隨機(jī)打成約 500bp 長(zhǎng)的片段 ,T4DNAPolymerase 、 Klenow Fragment 以及 T4PolynucleotideKinase 進(jìn)
5、行 5末端的修平和磷酸化 , Klenow Fragment exo-進(jìn)行 3末端加 A, T4DNA ligase連接通用接頭、PCR擴(kuò)增構(gòu)建噬菌體 ZZ1測(cè)序文庫(kù);Hiseq2000 上機(jī)測(cè)序 ,Velvet1.2.08進(jìn)行序列拼接。 2 鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1全基因組生物信息學(xué)分析應(yīng)用GeneMarkS軟件和 fgenesVO軟件預(yù)測(cè) ZZ1的蛋白編碼區(qū); 采用本地 BlastP 對(duì)所預(yù)測(cè)到的基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè), 利用 Batch CD-search 預(yù)測(cè)蛋白保守區(qū);用ProtParam tool預(yù)測(cè) ZZ1 蛋白的分子量和等電點(diǎn);用DNAStar Lasergene7.1 軟件預(yù)測(cè) Z
6、Z1 基因的 GC含量;用在線軟件 TMpred預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū);用 Mauve2.2.0和 CoreGenes3.5 分別在核酸水平以及蛋白水平進(jìn)行全基因組比較分析;用GenSkew分析 ZZ1基因組 GC偏移和預(yù)測(cè)復(fù)制起點(diǎn);用 tRNAscan-SE1.21和 ARAGORN進(jìn)行 tRNA預(yù)測(cè) ,Blastn對(duì)預(yù)測(cè)的 tRNA進(jìn)行相似性比對(duì); 密碼子偏嗜性分析采用EMBOSS (6.2.0) 軟件包中的 CUSP和 CAI 程序。3 鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1體內(nèi)失活因素及體外篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的建立及其初步評(píng)價(jià)調(diào)查小鼠體內(nèi)影響噬菌體ZZ1 活性的因素 , 包括采用噬菌斑減少中和試驗(yàn)
7、檢測(cè)小鼠血清中是否存在能中和噬菌體ZZ1 的天然抗體;觀察分析噬菌體 ZZ1在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué), 明確網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)ZZ1活性的影響;比較噬菌體 ZZ1 在補(bǔ)體滅活血清以及補(bǔ)體未滅活血清中對(duì)其敏感宿主菌AB09V的殺滅作用 , 分析血清補(bǔ)體對(duì) ZZ1 體內(nèi)抗菌活性的影響。選擇其他4 株新分離到的噬菌體 (F19、PG3、PG17和 L2), 體外實(shí)驗(yàn)中觀察到他們分別可以特異性感染并高效殺滅 4 株不同的多重耐藥致病菌( 肺炎克雷伯菌 KP-19, 陰溝腸桿菌 EC3,陰溝腸桿菌 EC17和銅綠假單胞菌 PA2)。利用血清中噬菌體的殺菌實(shí)驗(yàn)從這4 株噬菌體中初步篩選出可能具有治療作用的噬菌體
8、 , 進(jìn)一步觀察血清中殺菌呈陽(yáng)性的噬菌體通過(guò)尾靜脈注射后對(duì)全身感染致死量其宿主菌的小鼠的治療效果, 初步評(píng)價(jià)血清中噬菌體殺菌實(shí)驗(yàn)篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的效果。 結(jié)果 1 鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1 的生物學(xué)特性噬菌體 ZZ1 在鮑曼不動(dòng)桿菌 AB09V的菌苔上形成直徑為1-2mm的透明噬菌斑 , 表現(xiàn)出裂解性噬菌體的噬斑特征; 透射電鏡觀察顯示ZZ1 有一個(gè)較長(zhǎng)的二十面體立體對(duì)稱的頭部 ( 約 100nm長(zhǎng) 80nm寬 ) 和一個(gè)可以伸縮的尾部 ( 約 120nm長(zhǎng)), 此為有尾噬菌體目肌尾病毒科噬菌體的典型形態(tài);噬菌譜調(diào)查結(jié)果顯示ZZ1 對(duì)本研究涉及的非鮑曼不動(dòng)桿菌無(wú)裂解作用, 僅對(duì) 2
9、3 株鮑曼不動(dòng)桿菌中的3- 株顯示裂解作用 , 在相同培養(yǎng)條件下 , 這 3 株宿主菌對(duì) ZZ1 的敏感程度由大到小依次為AB09V.AB0901和 AB0902。一步生長(zhǎng)曲線顯示ZZ1 感染 AB09V后其潛伏期約為 9min, 爆發(fā)量約 200PFU/細(xì)胞。理化因素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ZZ1 可以耐受較寬的酸堿環(huán)境(pH4-9) 以及50和 60范圍的較高溫度。噬菌體 ZZ1在 35 39均可保持穩(wěn)定的最佳抗菌活性, 噬菌體 ZZ1 的基因組核酸不能被 RNase A (DNase Free) 降解 , 但可被 DNasel (RNase Free) 和 Hind降解 , 因此其基因組核酸
10、類型為dsDNA。對(duì)構(gòu)建好的噬菌體ZZ1基因組測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行雙端測(cè)序獲得總的讀長(zhǎng)數(shù)目為937,400 個(gè), 平均讀長(zhǎng)為 250bp, 最后應(yīng)用velvet軟件拼接出一條長(zhǎng)為166,801bp 的噬菌體基因組 , 其兩端帶有 114bp 的重復(fù)序列。2 鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1全基因組生物信息學(xué)分析ZZ1基因組非重疊序列全長(zhǎng) 166,687bp, 平均 GC含量為 34.4%, 低于鮑曼不動(dòng)桿菌GC含量 (38.9%39.2%);ZZ1基因組共預(yù)測(cè)到256 個(gè) CDS和 8 個(gè) tRNA,基因組平均每 lkb 編碼 1.5個(gè)基因 , 基因密度約為 93.6%, 基因長(zhǎng)度范圍為34aa1303aa,
11、 平均 203aa。 256個(gè)預(yù)測(cè)蛋白中 , 有 95 個(gè)(37.1%) 可注釋出功能 , 這些蛋白均是 T4-like蛋白 , 包括36 個(gè)噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白 ,21 個(gè)參與 DNA復(fù)制、重組、修復(fù)、包裝和加工處理的功能蛋白 ,11 個(gè)參與核酸代謝的蛋白 ,5 個(gè)參與噬菌體裝配調(diào)節(jié)的蛋白,7 個(gè)參與轉(zhuǎn)錄的蛋白 ,3 個(gè)參與翻譯的蛋白 ,3 個(gè)參與裂解宿主菌的蛋白,5 個(gè)參與關(guān)閉或改變宿主菌代謝的蛋白 ,2 個(gè)參與細(xì)菌與噬菌體相互作用的蛋白, 其余 2 個(gè)為移動(dòng)元件。在 161 個(gè)功能未知的 ZZ1預(yù)測(cè)蛋白中 , 有 37 個(gè)具有跨膜區(qū) , 有 23 個(gè)具有保守的結(jié)構(gòu)域。其中 ZZ1 的 CDS0
12、11被預(yù)測(cè)出屬多重耐藥超家族 , 其編碼的蛋白具有四個(gè)跨膜區(qū)。此外 , 在 ZZ1 的基因組中并未發(fā)現(xiàn)其他耐藥基因和毒力因子。噬茵體ZZ1 與GenBank中其他 4 株不動(dòng)桿菌屬噬菌體 (Acj9 、Acj61 、Ac42 和 133) 以及大腸桿菌噬菌體 T4 的比較基因組學(xué)研究揭示出11 組不同長(zhǎng)度的局部同線塊(localcolinear block, LCB),其中有 7 組 LCB (>10kb) 為 6 株噬菌體所共有。BlastP 和 CoreGenes分析顯示: ZZ1 的預(yù)測(cè)蛋白中有 110 個(gè)( 占總基因數(shù)的43%)與 T4 蛋白具有顯著相似性 (Evalue<
13、10-6);ZZ1 與 Acj9 、Acj61 、133 以及 Ac42 含有的同源基因總數(shù)分別為179、164、157 和 143 個(gè), 分別占噬菌體ZZ1總預(yù)測(cè)蛋白數(shù)的69.9%、64.1%、61.3%和 55.9%;這些結(jié)果表明ZZ1 與這 5 株噬菌體有共同的祖先 , 因此 , 噬菌體 ZZ1 屬于 T4-like噬菌體家族。 GCskew 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示 ZZ1 的復(fù)制起點(diǎn)在 nt81009, 復(fù)制終點(diǎn)在 nt1 。其中復(fù)制起點(diǎn)與 8 個(gè) tRNA所在的位置非常接近; ZZ1 編碼 tRNA的種類和數(shù)量雖與其他鮑曼不動(dòng)桿菌編碼的tRNA均不同 , 但其 tRNA與他們編碼的 tRNA卻
14、有著不同程度的核酸序列相似性, 這些高度保守的 tRNA可能具有某些可通過(guò)垂直進(jìn)化遺傳下來(lái)的重要的生物學(xué)功能。 此外 , 雖然 ZZ1編碼的 tRNA有一半以上 (5/8)攜帶的密碼子是噬菌體ZZ1 總蛋白高頻使用的密碼子, 但其他 4 株不動(dòng)桿菌屬噬菌體的 tRNA所攜帶的密碼子與噬菌體本身高頻使用的密碼子一致的并不到總tRNA的 50%。3 鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1體內(nèi)失活因素及體外篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的建立及其初步評(píng)價(jià)噬菌體ZZ1對(duì)絕對(duì)致死量的 AB09V感染小鼠無(wú)治療效果(p>0.05)。ZZ1 體內(nèi)失活原因的研究調(diào)查結(jié)果顯示, 小鼠血清中不存在可中和噬菌體 ZZ1 的天
15、然抗體 ,ZZ1 的失活與小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)噬菌體的清除也無(wú)直接關(guān)系 , 但血清補(bǔ)體與 AB09V的相互作用完全抑制了ZZ1 的吸附活性 , 這是導(dǎo)致ZZ1 在小鼠體內(nèi)失去抗菌活性的主要原因。因此 , 體外觀察噬菌體在離體組織( 如血清、抗凝全血、或其他組織的勻漿)中的抗菌活性可作為篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體的有效方法。為初步評(píng)價(jià)在離體組織中噬菌體殺菌實(shí)驗(yàn)篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的效果, 本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇了 4 株新分離到的在體外能高效殺滅其敏感宿主菌的噬菌體(F19 、PG3、PG17和L2), 在小鼠血清中具有殺菌作用的噬菌體共3 株, 分別是 F19、PG3和 PG17。這 3 株噬菌體
16、對(duì)全身感染絕對(duì)致死量細(xì)菌的小鼠的治療結(jié)果表明, 感染小鼠1 周內(nèi)的存活率在F19 噬菌體治療組為100%(8/8), 在 PG3噬菌體治療組為87.5%(7/8),在 PG17噬菌體治療組為87.5%(7/8) 。3 株噬菌體在小鼠各臟器對(duì)其敏感宿主菌的殺滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 噬菌體治療組小鼠各組織臟器含活菌量與無(wú)噬菌體治療對(duì)照組相比均有明顯降低(p<0.001)。此外 , 熱滅活噬菌體對(duì)感染小鼠均無(wú)治療作用( 存活率為 0%,0/8), 小鼠各組織臟器含菌量與無(wú)噬菌體治療對(duì)照組相比也均無(wú)明顯變化(p>0.05),說(shuō)明小鼠各臟器活菌數(shù)的減少與噬菌體的非特異性免疫增強(qiáng)作用無(wú)關(guān)。這些結(jié)果均證明:3 株血清中殺菌呈陽(yáng)性反應(yīng)的噬菌體通過(guò)尾靜脈注射后對(duì)全身感染絕對(duì)致死量其宿主菌的小鼠具顯著治療效果。此結(jié)果初步證實(shí)了本研究所建立的在離體組織中噬菌體的殺菌實(shí)驗(yàn)篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的有效性。結(jié)論1. 噬菌體 ZZ1是一株有尾噬菌體目肌尾病毒科的裂解性噬菌體。鮑曼不動(dòng)桿菌 AB09V是其最為敏感的宿主菌 , 在其菌苔上形成直徑為1-2mm的透明噬菌斑 , 感染潛伏期為 9min, 爆發(fā)量為 200PFU/cell;ZZ1 在極端溫度和極端 pH 的環(huán)境下具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性, 在 35 39均可顯示最佳的抗菌
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