探索CeA在抑郁以及抑郁引起的痛覺減退中的作用

1、探索CeA在抑郁以及抑郁引起的痛覺減退中的作用臨床上經(jīng)常觀察到抑郁和疼痛兩種疾病的共病現(xiàn)象。疼痛特別是慢性痛，經(jīng)常伴隨抑郁癥狀的存在，而抑郁癥患者也會伴發(fā)腰背痛、關(guān)節(jié)痛等多種軀體癥狀。闡明兩者共病的機制對于臨床慢性痛的治療有重要的意義。近年來，在臨床和實驗室研究中均發(fā)現(xiàn)抑郁會降低個體對誘發(fā)痛的敏感性，但目前對這一現(xiàn)象的潛在機制并沒有詳盡的研究。抑郁會伴隨杏仁核活動增加，同時杏仁核也參與對疼痛信息的加工與調(diào)控。杏仁中央核 (CeA) 是杏仁核的主要輸出核團，所以本研究利用慢性不確定溫和應激 (UCMS) 建立大鼠抑郁模型，然后在 CeA內(nèi)注射 GABAA受體激動劑蠅蕈醇 (muscimol)，通

2、過抑制 CeA 的活動，觀察大鼠抑郁樣行為以及輻射熱誘發(fā)痛行為的改變，旨在探索 CeA 在抑郁以及抑郁引起的痛覺減退中的作用。方 法1. 動物分組與實驗流程選用體重為 220 250 g 的成年雄性 wistar 大鼠50 只，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。動物自由進食，單籠飼養(yǎng)于 22和 12 h 晝夜循環(huán)的環(huán)境中。動物在正式實驗前適應 1 周，每天撫摸 3 5 min。動物適應期結(jié)束后，測試基線糖水偏好和輻射熱痛閾。根據(jù)糖水偏好和輻射熱痛閾值將 50 只大鼠分為正常 / 鹽水 (n = 12)、正常 /muscimol (n = 12)、UCMS/ 鹽水 (n = 13) 和 UCMS/

3、muscimol (n = 13) 4組進行實驗。UCMS 組大鼠接受為期 6 周的慢性不確定溫和應激，正常（控制）組不做任何處理。應激過程中，每周一次固定時間測試動物的糖水偏好和體重。6 周后，再次測試所有動物的輻射熱痛閾。第 6 周糖水偏好測試之后 2 d，根據(jù)分組向大鼠雙側(cè)CeA 微量注射 GABAA受體激動劑 muscimol 或同等體積的生理鹽水，1 h 后進行糖水偏好測試。2 d 后，再次根據(jù)分組向大鼠雙側(cè) CeA 微量注射 muscimol或同等體積的生理鹽水，1 h后進行輻射熱痛閾測試。實驗流程簡圖（見圖 1）。整個實驗中抑郁組動物和控制組動物獨立飼養(yǎng)在不同的房間，以避免相互影

4、響。2. UCMS 抑郁模型建立與糖水偏好測定大鼠 UCMS 抑郁模型的建立方法為：以 2 周為一個周期，各種應激以偽隨機的方式給予。應激包括 22 h 和 40 h 的水剝奪；20 h 和 22 h 的食物剝奪；1 h 的空瓶應激 ( 在斷水 40 h 后立即給予空瓶 )；1次3 h的限制飲食(在斷食20 h后給予兩小片食物)；8 h 和 16 h 的斜籠子 (45 度 )；7 h 和 8 h 的頻閃光；2 次 16 h 的群養(yǎng) (8 只老鼠 1 個籠子 )；2 次 16 h 的持續(xù)照明；2 次 5 h 的白噪音 (75 dB)；2 次 16 h 的氣味應激；2 次 30 min 的熱房間以

5、及 2 次 30 min 的冷房間。抑郁大鼠接受持續(xù)連續(xù) 6 周的應激，抑郁水平通過糖水偏好測試測定。糖水測試在動物應激前(基線水平 ) 以及應激過程中每周測試一次。實驗前進行糖水測試的訓練，給予動物1瓶水和1瓶糖水(1%蔗糖溶液 )，24 h 后，糖水和水瓶左右交換，再給予 24 h。讓動物習慣分辨糖水和水。然后，進行正式的糖水基線的測試，斷水斷食 22 h 后，同時給予動物 1 瓶水和 1 瓶糖水，讓動物自由飲用 1 h。通過稱量測試前后糖水和水的重量，計算大鼠在 1 h內(nèi)飲用糖水和水的重量，再依據(jù)下列公式計算大鼠糖水偏好值： 糖水偏好 = 糖水的飲用量 /( 糖水的飲用量 + 水的飲用量

6、 )×100%。3. 輻射熱痛閾測定輻射熱通過 1 個 100 瓦的燈泡給予，光線經(jīng)聚焦后由直徑 4 mm 的小孔投射出來，透過 1 mm 厚的有機玻璃板垂直照射大鼠后肢足底，動物出現(xiàn)回避行為后手動關(guān)閉輻射熱燈。抬腳潛伏期是指每次開始給予足底熱刺激直到大鼠抬腳之間的時間間隔。設(shè)定最大結(jié)束時間為 22 s，以防止組織損傷。調(diào)整照射強度使得正常大鼠的抬腳潛伏期為 10 s 左右。每只大鼠接受 5 次足底熱刺激，同 1 只大鼠兩次熱輻射刺激之間至少間隔 5 min，取后 4 次熱輻射刺激的縮腳閾值進行平均用于統(tǒng)計學檢驗。4. 埋管手術(shù)及腦內(nèi)微量注射1% 戊巴比妥鈉 50 mg/kg 腹腔

7、注射麻醉大鼠。不銹鋼套管 (30 gauge) 通過立體定位系統(tǒng)埋入 CeA，CeA 腦區(qū)的定位為前囟后 2.8 mm，旁開 4.0 mm，距離顱骨表面深 7.5 mm。引導套管用 3 個螺絲以及牙科水泥固定于顱骨。直到注射藥物前每個引導套管用 1 個消毒的套管芯使之保持封閉。大鼠休息 7 d 后進行正式實驗。微量注射針通過引導套管直到最底端低于引導套管 1 mm。微量進樣器連接一個內(nèi)含空氣泡的聚乙烯導管，監(jiān)測皮層內(nèi)給藥。將 muscimol ( 購于 Tocris 公司 , 產(chǎn)自 Ellisville) 微量注射到雙側(cè) CeA( 每側(cè) 0.5 μg/0.5 μl，溶于生理鹽水 )

8、，此劑量的muscimol 可以有效地抑制 CeA 的活動。對照組大鼠接受相同體積的生理鹽水。注射過程持續(xù) 1 min，之后注射針在套管中停留 1 min，使得針尖處的藥物最大限度擴散。5. 組織學定位實驗結(jié)束后，在大鼠 CeA 內(nèi)注射 1% 的滂胺天藍 0.5 μl，灌流取腦，冰凍切片 (50 μm 厚 )。切片用 HE 染色。根據(jù)圖譜在顯微鏡下鑒定微量注射點位置 , 定位不準確者不列入統(tǒng)計。注射位點的組織學定位（見圖 2）。6. 統(tǒng)計學方法應用 Prism 5.0 統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)和作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標準誤 (x±SEM ) 表示。數(shù)據(jù)包含兩個

9、或者三個因素的情況下采用多因素方差分析，Bonferroni 作為多重比較的事后檢驗方法。以 P 0.05)。經(jīng)過 6 周應激后，UCMS 組與控制組相比體重顯著降低 (P 0.05)；而 UCMS 組注射muscimol 后糖水偏好顯著增加 (P 0.05，見圖 4 B)。討 論本研究發(fā)現(xiàn)向 UCMS 抑郁造模后的大鼠 CeA內(nèi)注射 muscimol 抑制 CeA 的活動可以緩解抑郁水平以及抑郁產(chǎn)生的痛覺減退。在本研究中筆者采用了大鼠的 UCMS 抑郁模型模擬臨床抑郁患者。該模型由一系列慢性的不確定預期的溫和應激組成，模擬人類日常生活中遇到的各種應激。經(jīng)過 6 周的應激處理，UCMS 組大鼠

10、與控制組相比體重顯著降低，糖水偏好下降，抑郁模型成功建立。同時筆者發(fā)現(xiàn)UCMS 組大鼠的輻射熱誘發(fā)痛閾顯著增加，這一結(jié)果再次驗證了本次研究之前的結(jié)論，即抑郁會降低個體對誘發(fā)痛的敏感性。抑郁狀態(tài)會伴隨杏仁核在結(jié)構(gòu)和功能上都發(fā)生改變。抑郁患者杏仁核的體積增大，在清醒和睡眠狀態(tài)下杏仁核局部腦血流量增加，并且抗抑郁治療可以降低杏仁核的活動。杏仁核活動異常增加可能與 GABA 受體功能降低有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)自殺的抑郁患者杏仁核內(nèi) GABAA受體的 mRNA 表達降低。所以在本研究中向 UCMS 抑郁樣大鼠杏仁中央核內(nèi)注射 GABAA受體激動劑抑制杏仁中央核的活動使糖水偏好增加，緩解了大鼠的抑郁癥狀。杏仁核

11、是疼痛下行調(diào)控的重要結(jié)構(gòu)，參與情緒對疼痛的調(diào)控。杏仁中央核是杏仁核的主要輸出核團，它接收基底外側(cè)杏仁核傳入的與情緒有關(guān)的信息，并將其與脊髓 - 臂旁 - 杏仁中央核上傳的傷害性信息進行整合。由杏仁中央核下行投射到中腦導水管周圍灰質(zhì)（Periaqueductal gray, PAG）經(jīng)由延髓頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)（Rostral ventromedial medulla,RVM）RVM 作用于脊髓的疼痛下行抑制通路是情緒鎮(zhèn)痛的重要路徑。抑郁狀態(tài)下個體對誘發(fā)痛敏感性降低可能是杏仁中央核活動異常增加，疼痛下行抑制路徑過度激活所致。所以本研究中向 CeA 內(nèi)注射 muscimol 可能使疼痛下行抑制降低，從而減

12、輕了抑郁引起的誘發(fā)痛不敏感。另外，本研究發(fā)現(xiàn)向正常大鼠 CeA 內(nèi)注射muscimol 使輻射熱抬腳潛伏期顯著增加。前人的研究發(fā)現(xiàn)損毀杏仁核后雖然應激鎮(zhèn)痛消失，但并不影響甩尾測試的基線值。也有研究發(fā)現(xiàn)損毀或抑制 CeA 的活動只影響疼痛的情緒維度，對感覺維度沒有影響。在本研究中，筆者采用的是相對較高的劑量 (500 ng)，有文獻報道高劑量 (200 ng) 的muscimol 有鎮(zhèn)靜作用，可能會影響運動功能。與甩尾測試相比，抬腳反應更多依賴于許多肌群的協(xié)調(diào)工作，所以本研究中抬腳潛伏期增加可能與高劑量 muscimol 的鎮(zhèn)靜作用有關(guān)。綜上所述，UCMS 抑郁樣大鼠杏仁中央核內(nèi)注射 musci

13、mol 抑制杏仁中央核活動可以緩解抑郁水平以及抑郁引起的痛覺不敏感。所以，杏仁中央核活動異常增加是抑郁引起痛覺異常的重要原因。這為臨床上探索抑郁與疼痛共病的機制提供了重要證據(jù)。參 考 文 獻1 Bar KJ, Terhaar J, Boettger MK, et al. Pseudohypoalge-sia on the skin: a novel view on the paradox of painperception in depression. J Clin Psych-opharmacol,2011, 31:103 107.2 Kundermann B, Hemmeter-Spern

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