第十二單元移植免疫學檢測ppt課件

1、微量淋巴細胞毒試驗（Microcytotoxicity assay）是在經典的補體依賴的淋巴細胞毒試驗（complement dependent cytotoxicity，CDC）基礎上發(fā)展而來的一項實驗技術，目前已經廣泛應用于器官移植供、受者間的交叉配型、復發(fā)性流產的封閉抗體檢測等多個領域。在器官移植的文獻中提及的CDC法多指微量淋巴細胞毒法,微量淋巴細胞毒試驗概念,器械 微量淋巴細胞毒反應板（泰薩奇板）、倒置熒光顯微鏡、 微量移液器、吸管、溫箱、離心機、磁架等 。 試劑 淋巴細胞分離液(Ficoll, 1.077)、T/B淋巴細胞分離磁珠及洗滌液、凍干補體、熒光染色液、供者全血23ml（E

2、DTA或ACD抗凝）、受者血清2ml、陰性對照血清（可用1640培養(yǎng)液或PBS替代）、陽性對照血清（抗全淋 巴細胞抗體ALG/ATG,實驗器材和材料,淋巴細胞的分離（Ficoll法）： 1. 將供者全血用PBS(pH7.4)緩沖液 按1:1稀釋，混勻備用； 2. 取15ml離心管一支，加入一定體積的Ficoll液，用吸取稀釋后的供者全血，沿試管壁緩慢加入，使全血置于Ficoll上層。Ficoll液與稀釋后的全血體積之比為1:2； 3. 15002000rpm/min（半徑15cm水平轉子）離心10min； 4. 取出離心管，吸取中間白膜層，置于另一干凈離心管中； 5. 加入PBS，洗滌； 6.

3、 2000rpm/min離心5min，傾出上清液； 7. 重復步驟5、6； 8. PBS液調整細胞濃度為2109/L,實驗方法,淋巴細胞毒反應（一步法） 1. 于泰薩奇板每孔中加入5l石蠟油，以防反應物揮發(fā)； 2. 建立反應格局，每位待測標本均應設立陰性對照、陽性對照； 3. 分別于各相應孔中加入1l淋巴細胞（混合淋巴細胞、T淋巴細胞、淋巴細胞）、1l待測血清以及2l補體； 4. 2225溫度下孵育1h； 5. 熒光染色液染色并終止反應,結果應在染色后10分鐘內觀察，以防熒光猝滅。特殊情況不能立即觀察時，應將反應板用避光紙包緊，置于4冰箱中，盡早觀察結果。死亡細胞由于熒光染料進入而呈紅色（染料

4、中的EB與DNA結合），體積略為增大?；罴毎驗榧毎ね暾拭髁恋木G色（染料中的CFDA與細胞膜蛋白結合），具有強折光性,結果觀察,根據(jù)死亡細胞占全部細胞的百分比來計分，目前普遍采用國際通用的NIH計分方法，如下表。判斷死細胞的百分比需要操作者具備一定的工作經驗，大致原則為：可疑2分，30為4，過半記6，強陽寫8,結果判斷,淋巴細胞毒試驗記分標準,1. 每份標本都必須設立陰、陽性對照； 2. 溫度過低有可能產生假陰性結果； 3. 只有當陰性和陽性對照結果準確時，該實驗的陽性和陰性結果方能成立,注意事項,淋巴細胞毒試驗是測定患者機體內是否含有特異性針對供者的淋巴細胞毒抗體，檢測的是HLA特異性

5、的IgG和IgM抗體，包括HLA-I類抗體和II類抗體。由于混合淋巴細胞中主要為T淋巴細胞，B淋巴細胞數(shù)量較少，而HLA-II類抗體在T淋巴細胞表面不表達，僅在B淋巴細胞表面表達，因而，利用混合淋巴細胞進行CDC試驗時，對HLA-I類抗體陰性、II類抗體陽性的患者，易產生漏檢，而造成這種結果的原因是由于混合淋巴細胞中B淋巴細胞占全部細胞的比例較少所致。 為了更加真實、全面地反應患者的免疫狀態(tài)，我們應該如何改善上述局限性對實驗結 果造成的影響,南方醫(yī)科大學 裘宇容,實驗討論,實驗二 群體反應性抗體檢測,群體反應抗體（Pannel reactive antibody）是指存在于某些人體內的抗人類白

6、細胞(HLA)抗體，可通過輸血、輸血小板、妊娠以及器官移植等免疫途徑獲得。PRA測定即是檢測患者體內是否存在HLA抗體、抗體的水平高低以及抗體特異性如何。PRA對于患者是否發(fā)生排斥、移植物的存活狀態(tài)以及器官功能的實現(xiàn)都有著不可忽視的作用,群體反應性抗體的概念,實驗原理,將涵蓋不同地域、不同人種的HLA-I類和II類純化IgG抗原預先包被于泰薩奇微孔板中，與待測、血清反應，再加入堿性磷酸酶標記的二抗，孵育后加入酶作用底物，待顯色反應完成后終止反應。如果待測血清中存在HLA-I類抗體，則相應的HLA-I類混合抗原孔中會發(fā)生特異性的抗原抗體反應，反應孔呈現(xiàn)藍色的陽性反應結果；若無相應抗體，則反應孔中

7、為無色陰性結果,器械： 各種移液器、吸頭、溫箱、離心機 、微量酶標儀等。 試劑： 抗原微孔板（以LAT mix tray為例） 對照血清（10serum control） 去離子水(sterile deionized water) 酶標二抗（100alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG) 抗體稀釋液（1antibody diluent） 洗液（10wash buffer） 底物A和B（1colorimetric enzyme substrate A&B） 反應終止液（1stop reagent,實驗器材和材料,試劑準備 1. 在第一次使用時

8、，至少提前20min取出凍干對照血清以2ml去離子水輕輕搖震使其徹底溶解。將溶解后的對照血清溶液分裝，每管100l，儲存在-20冰箱中，每次實驗前取出，恢復至室溫后使用； 2. 將洗液用去離子水(sterile deionized water)按1：9稀釋，可根據(jù)工作頻率一次性配制一定量的工作液，4冰箱貯存?zhèn)溆茫?3. 將待測標本用抗體稀釋液（antibody diluent)按1：2稀釋，約60l/test； 4. 酶標二抗（alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG)在第一次洗滌之前用抗體稀釋液按1：100稀釋，50l/test； 5. 底

9、物A、B (colorimetric enzyme substrate A&B)在第二次洗滌之前按1：1比例混勻，50l/test,實驗方法,酶聯(lián)免疫吸附反應 1. 根據(jù)反應格局表，將待測血清和各種對照品加入相應的孔中，每孔10l（陰性對照孔加入抗體稀釋液，陽性對照孔和質控孔加入對照血清）； 2. 蓋好反應板，2225孵育60min； 3. 用力將反應板中的血清甩出，并在墊有紙巾的實驗臺面上叩擊反應板兩至三次，在加入下一液體前，請注意加蓋，保持反應孔濕潤； 4. 于每孔中加入洗液(wash buffer) 20-30l， 輕輕晃動反應板，甩出洗液，叩擊反應板兩至三次； 5. 再重復步驟9兩次；

10、 6. 加入10ul酶標二抗，輕輕晃動反應板, 2225孵育40min； 7. 重復步驟9三次； 8. 每孔加入10l混合好的底物，37避光孵育1015min（一般不要超過15min）； 9. 待質控孔和陽性對照變成深藍色后, 每孔加入5l 終止液(stop reagent)，蓋上反應板，15分鐘后觀察結果,肉眼觀察反應結果，藍色或深藍色為陽性, 無色為陰性，陽性結果的顏色深淺程度與待測標本HLA抗體水平的高低成正比。有條件時可在微量酶標儀上讀取吸光度值，并根據(jù)陰、陽性對照的吸光度值判定標本的陰、陽性。盡量在顯色終止反應后1小時內讀取反應結果，上機前請移去反應板蓋。如因特殊情況需延遲觀察結果時

11、，請將反應板貯存于25冰箱中，此情況下可能會引起反應孔吸光度值降低，產生假陰性結果,觀察結果,注意事項,洗滌 洗滌是ELISA實驗中關鍵的步驟，如洗滌不充分，則可能出現(xiàn)本底過高的現(xiàn)象；但洗滌過度，亦可能丟失一些陽性反應； 溫度 除二抗反應過程外，本實驗以2225為宜，溫度過高或過低都會對實驗結果產生不同性質的干擾； 對于強陽性標本，可加大稀釋倍數(shù)后再進行檢測； 本實驗的難點為陽性結果的評價和判斷，因此，如果操作者具備豐富的HLA專業(yè)基礎知識，將會大大提高本實驗結果判斷的可靠性和準確性,結果評價標準 1. 依據(jù)實驗條件不同，各實驗室結果具有不同的波動范圍； 2. 當空白對照、陰性對照、陽性對照以

12、及質控孔的OD值均在試劑盒可接受范圍時，說明實驗結果準確可靠； 3. 肉眼判斷結果時，應根據(jù)反應孔的顏色深淺計分，計分方法同“微量淋巴細胞毒試驗”，以0，2，4，6，8分來表示反應由弱至強的程度。 4. 對于HLA混合抗體檢測，建議4分以上為陽性。對于2分結果的定義是本實驗的難點，應結合患者機體免疫狀態(tài)而定,結果分析,Cut-off值的確定 不同的HLA抗體檢測試劑盒，可設置不同的調節(jié)Cut-off值，建議在HLA抗體初篩時適當下調Cut-off值； 對于HLA抗體特異性及抗體水平的檢測，可根據(jù)試劑盒類型（LAT1240/1288/1HD/240）相應上調Cut-off值。 調節(jié)Cut-off

13、值的計算： 調節(jié)Cut-off（陽性孔均值空白均值）校正系數(shù)空白均值 PRA值的計算 PRA陽性孔數(shù)/總檢測孔數(shù)100,南方醫(yī)科大學 裘宇容,如孔2A2E均為陽性，根據(jù)反應工作表格局，說明抗體特異性為抗HLA-A1抗體；如孔2A2E中有3孔強陽性，而2孔陰性，應該如何分析,實驗討論,實驗三 病例討論,病歷 患者吳xx,女性，39歲，漢族，廣東省汕頭籍，家住汕頭市鱸崗鎮(zhèn)，2007年5月18入院。 主訴： 尿檢、腎功異常6年，加重半年。緣于2001年5月無明顯誘因出現(xiàn)頭暈，腰酸痛，在當?shù)蒯t(yī)院就診，査尿常規(guī)提示尿蛋白（+），腎功異常（肌酐130umol/L左右），給予對癥治療（具體不詳），癥狀緩解。

14、此后病情平穩(wěn)。監(jiān)測腎功肌酐逐步上升，2006年9月為200umol/L,11月再次出現(xiàn)頭暈，伴惡心，嘔吐，測肌酐達700umol/L,就診于西安某醫(yī)院，診斷“慢性腎功不全尿毒癥期”，行左前臂內瘺術，術后內瘺栓塞。擬行腎移植術，但因無合適供體，回當?shù)蒯t(yī)院繼續(xù)治療。2007-5-15復查肌酐1400umol/L,為行腎移植術，就診我院，門診以“慢性腎功能不全尿毒癥期”收入科。病程中精神、飲食一般。24小時尿量1400ml左右，大便正常，體重無明顯變化。婚育史：患者23歲已婚，生有2子3女，流產1次,查體： 體溫 36.6 0C，脈搏80次/分，呼吸18次/分，血壓150/100mmHg發(fā)育正常，營

15、養(yǎng)中等，神志清楚，精神欠佳，慢性病容，貧血貌，全身皮膚、黏膜無黃染，全身淺表淋巴結未觸及腫大。頸靜脈無怒張，頸動脈無異常搏動，未捫及包塊，甲狀腺不腫大，氣管居中，頸軟無抵抗。胸廓對稱無畸形，無局限性隆起，雙側乳房對稱，未捫及腫塊。胸壁未見靜脈曲張，胸式呼吸存在，節(jié)律規(guī)整，叩診呈清音，肺肝界位于右鎖骨中線第5肋間，雙肺呼吸音清，未聞及干濕性羅音及胸膜摩擦音。心前區(qū)無隆起，心尖搏動不明顯，未見異常搏動，心界不大，心率80次/分，律齊，各瓣膜聽診區(qū)未聞及病理性雜音，無心包摩擦音。腹平坦，腹肌軟，全腹無壓痛及反跳痛，未捫及包塊，肝脾肋緣下未觸及。肝脾及雙腎區(qū)無叩擊痛，移動性濁音陰性，腸鳴音正常35次/

16、分。生理反射存在，病理反射未引出。?？茩z查: 雙側肋脊角未見異常隆起，皮膚無紅腫，雙腎區(qū)平坦，未觸及包塊，雙側肋脊點無明顯壓痛，雙腎區(qū)無叩擊痛，未聞及血管雜音。雙側輸尿管行徑無壓痛點，恥骨上區(qū)無膨隆及壓痛，膀胱叩診空虛,實驗室檢查： 血常規(guī)：WBC 4.42G/L，NEU% 68.5%，RBC 2.37G/L，HGB 60g/L，HCT 0.193,PLT 132G/L；血型：“B”型；血生化：BUN 25.4mmol/L，Cr 975umol/L,GLU 4.7mmol/L，K+ 3.51mmol/L，Ca22.13mmol/L，TG1.35mmol/L，Tco2 21.1mmol/L；肝功能轉氨