斑馬魚動物模型的應(yīng)用介紹

1、斑馬魚動物模型的應(yīng)用斑馬魚（Danio rerio）屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）鯉科（Cyprinidae）短擔尼魚屬（Danio）的一種硬骨魚，原產(chǎn)于南亞，是一種常見的熱帶觀賞魚，因其體側(cè)具有斑馬一樣暗藍與銀色相間的紋條而得名。斑馬魚個體小，易于飼養(yǎng)，成體長4-5cm，雄魚體修長，雌魚體肥大?？稍谟邢蘅臻g里養(yǎng)殖相當大的群體，可滿足樣本需求量大的研究。斑馬魚發(fā)育迅速，在28.5培養(yǎng)條件下受精后約40min完成第一次有絲分裂，之后大約每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相當于28d的人類胚胎，幼魚孵出后約3個月達到性成熟。雌雄魚通過調(diào)控光周期控制14:10（光照:黑

2、暗）產(chǎn)卵時間，成熟魚每周可產(chǎn)卵一次，一尾雌魚每次可產(chǎn)卵100-300枚。胚胎體外受精，體外發(fā)育，胚體透明，易于觀察。受精卵直徑約1mm，易于進行顯微注射和細胞移植等操作。一、斑馬魚的品系經(jīng)過30多年的研究應(yīng)用和系統(tǒng)發(fā)展，已有約20個斑馬魚品系，斑馬魚基因數(shù)據(jù)庫-ZFIN（http:/zfin/org）里有相關(guān)的資料可供查詢和下載。目前研究中常用的斑馬魚野生型品系主要為AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑馬魚基因組計劃所用品系是Tu。AB品系是實驗室常用的斑馬魚品系，由單倍體細胞經(jīng)早期加壓法獲得。Tu品系斑馬魚具有胚胎致死突變基因，用于基因組測序前敲除該致死突變基因。WI

3、K品系較Tu品系具有更多的形態(tài)多樣性。此外，還保存有3000多個突變品系和100多個轉(zhuǎn)基因品系。這些品系資源對于利用斑馬魚開展各種科學研究起著很大的推動作用。二、斑馬魚突變品系的篩選斑馬魚突變的方法主要有三種：已基亞硝脲（ENU）化學誘導(dǎo)、或射線照射和插入誘變。ENU是一種DNA烴基化試劑，在生殖細胞減數(shù)分裂前誘導(dǎo)堿基對的替換，誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變率為0.1%-0.2%，涉及單個基因的突變。射線照射導(dǎo)致染色體大片段的缺失或染色體重排，產(chǎn)生突變率達1%。插入誘變是以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，用顯微注射法將目的基因片段導(dǎo)入斑馬魚受精卵，整合到基因組中，干擾正?；虮磉_。射線照射產(chǎn)生的突變率是ENU化學誘導(dǎo)的10

4、倍，但由于突變涉及多個基因，突變的表型是受若干基因調(diào)控的結(jié)果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化學誘導(dǎo)法是斑馬魚突變的主要方法。研究含有純合致死基因或隱形突變基因的突變表型時，可通過早期加壓法（EP）處理母本獲得的單倍體卵細胞獲得二倍體純合子。三、斑馬魚作為人類疾病動物模型的生物學特性斑馬魚在基因水平上87與人類同源，早期發(fā)育與人類極為相似，已成為研究相關(guān)疾病基因的最佳模式生物。篩選斑馬魚胚胎或成魚基因庫中類似于人類致病或特定功能的基因，構(gòu)建進斑馬魚受精卵中，觀察特定基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程所起作用。斑馬魚胚胎發(fā)育是全透明的，可以全程觀察并研究其發(fā)育狀況。目前，斑馬魚模式生物的使用正逐漸拓展

5、和深入生命體的多種系統(tǒng)（例如，神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等）的發(fā)育、功能和疾?。ɡ?，神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病等）的研究中，并已用于小分子化合物的規(guī)模新藥篩選。3.1神經(jīng)系統(tǒng)模型斑馬魚研究表明，神經(jīng)特異性鈉離子通道大量表現(xiàn)在中樞和周邊感覺神經(jīng)系統(tǒng)，有效調(diào)控神經(jīng)的興奮性，其基因表達調(diào)控及信號通路是神經(jīng)學研究重點。阿爾茨海默氏?。ˋD）是一種由于大腦神經(jīng)細胞死亡而造成的神經(jīng)退行性疾病。AD與淀粉樣蛋白（A）的過量表達沉積有關(guān)，A是由APP連續(xù)切割產(chǎn)生，而早老素增強子（pen-2）和前咽陷子（Aph-1）參與A的產(chǎn)生。研究表明，將斑馬魚相關(guān)基因的表達進行敲除，發(fā)現(xiàn)Pen-2與P5

6、3依賴型神經(jīng)細胞的存活有重要作用。并且在構(gòu)建綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，發(fā)現(xiàn)在2-3月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚大腦中，廣泛大量表達GFP-APP。這些說明斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育在進化上和人類的保守關(guān)系。帕金森氏?。≒D）與多巴胺能（DA）通路的破壞有關(guān)。神經(jīng)毒物MPTP對人類中腦多巴胺能神經(jīng)細胞的損傷現(xiàn)象與PD類似。研究者將多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白抑制物和MPTP共同作用于斑馬魚幼魚，發(fā)現(xiàn)這些藥物具有保護多巴胺能神經(jīng)細胞的作用。3.2心血管系統(tǒng)模型斑馬魚胚胎期和幼魚期為透明體，這為心血管發(fā)育的研究提供了良好模型。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的心臟受損后具有自動修復(fù)功能，這是首次發(fā)現(xiàn)脊椎動物的心臟具有再生功能，為探尋

7、人類心臟受損修復(fù)帶來希望。斑馬魚突變品系可作為研究心臟節(jié)律、心臟管形成、瓣膜發(fā)生和心臟環(huán)化的模型。例如，突變品系gridlock（gdl）可用于研究人類主動脈縮窄疾病?？寺∨c斑馬魚同源的人類載脂蛋白基因apoE和apoA-1，發(fā)現(xiàn)這些蛋白對哺乳動物脂質(zhì)的吸收和分布具有重要作用，而Apo-1在AD治療中也有重要作用。胚胎注射血管內(nèi)皮因子（VEGF）的斑馬魚在發(fā)育過程中可以觀察到明顯的新生血管，而腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移又與血管新生有密切關(guān)系，這啟發(fā)人們通過阻斷VEGF抑制血管增生而治療腫瘤。3.3免疫疾病模型和感染疾病模型斑馬魚具有較完整的特異性免疫系統(tǒng)，體內(nèi)的T淋巴細胞和B淋巴細胞具有免疫活性，非特異

8、性免疫系統(tǒng)也呈現(xiàn)出與人類的相似性，同時保留了TLR信號通道。成魚體內(nèi)注射細菌和胚胎浸沒感染法可使斑馬魚感染細菌，有效建立相應(yīng)的細菌發(fā)病機理研究模型。海分枝桿菌感染的斑馬魚體內(nèi)的肺結(jié)核肉芽腫和人類一樣出現(xiàn)干酪樣壞死，該模型可能在肺結(jié)核研究中發(fā)揮重要作用。 3.4腫瘤模型腫瘤是造成人類死亡的主要原因之一，斑馬魚可以自發(fā)產(chǎn)生腫瘤，并且許多腫瘤與人類腫瘤非常相似，因此，斑馬魚作為最有前途且最廉價的模式生物而被廣泛的應(yīng)用。腫瘤模型的構(gòu)建主要是通過移植術(shù)、化學誘變和基因突變獲得。移植術(shù)即直接將腫瘤細胞注射到不同發(fā)育階段的斑馬魚的特定部位，或者將含有GFP表達基因的腫瘤細胞顯微注射到斑馬魚胚胎或幼魚中?；瘜W

9、誘變可以快速獲得斑馬魚腫瘤模型，例如，誘變劑處理斑馬魚胚胎或幼魚可以獲得肝癌、血管瘤、細胞間質(zhì)瘤等。但是化學誘變會引起非特異性表型，而且腫瘤定位困難?；蛲蛔儎t是將含有GFP報告基因的腫瘤基因通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到斑馬魚體中，可用以進一步鑒定腫瘤發(fā)生的分子機制。3.5視網(wǎng)膜自動修復(fù)機能 斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚視網(wǎng)膜具有可再生放射狀膠質(zhì)細胞，這些細胞可分化為健康的視網(wǎng)膜細胞，并能自動修復(fù)受損視網(wǎng)膜。人類視網(wǎng)膜擁有類似斑馬魚的放射狀膠質(zhì)細胞，但是這些細胞無活性。研究人員已成功將放射狀角質(zhì)細胞分化的視網(wǎng)膜細胞移植到老鼠上，這為激活人類放射狀膠質(zhì)細胞的研究奠定了重要的基礎(chǔ)。四、斑馬魚在發(fā)育遺傳學中的應(yīng)用斑馬魚

10、作為發(fā)育生物學模式生物有很多優(yōu)勢，胚胎清透可見，從受精卵發(fā)育到完整的胚胎形成只需24h，發(fā)育過程便于觀察。GFP轉(zhuǎn)基因技術(shù)的運用可對特定組織進行實時觀察?？蓪ε繕颖具M行免疫組化或熒光免疫研究?？蓪ε咛ミM行顯微注射DNA或RNA，影響基因表達。嗎啉代（morpholino）基因敲除技術(shù)和異位基因表達技術(shù)是目前斑馬魚發(fā)育遺傳學研究中的新興技術(shù)。2000年，有研究者提出注射嗎啉代修飾性寡聚核苷酸可產(chǎn)生基因敲除斑馬魚。嗎啉代有抑制翻譯起始，減少傳統(tǒng)反義寡聚核苷酸非特異性的效應(yīng)。注射嗎啉代能產(chǎn)生以往證實的基因突變的擬表型，有助于確定功能基因。嗎啉代寡核苷酸正成為快速、高效的基因敲除方法。對越早期胚胎注

11、射外源基因，基因表達范圍就越廣，異位基因表達技術(shù)就是為使基因在斑馬魚特定細胞、組織和特定時間表達而建立的一系列新技術(shù)。如RNA caging技術(shù)，RNA與RNA caging共價結(jié)合時處于非活性狀態(tài)，經(jīng)特定波長照射，RNA caging被破壞，激活RNA，基因得以表達。同樣，激光誘導(dǎo)基因表達技術(shù)即外源基因與熱休克蛋白啟動子重組，激光熱敏效應(yīng)啟動基因表達。五、斑馬魚在生態(tài)毒理學中的應(yīng)用斑馬魚模型最早用于發(fā)育生物學和遺傳學研究，近幾年，斑馬魚模型逐漸應(yīng)用于生態(tài)毒理研究和檢測技術(shù)。5.1常規(guī)毒性實驗中的應(yīng)用斑馬魚模型可用于急性毒性實驗、慢性毒性實驗，以及蓄積毒性實驗。斑馬魚急性毒性實驗用于檢測各種農(nóng)

12、藥、有機試劑和污染物等的急性毒性。斑馬魚胚胎比成年斑馬魚敏感，對于急性毒性方面是一個很好研究模型，可于顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育的生態(tài)毒理學終點。慢性毒性實驗測定低濃度污染物在斑馬魚生活周期內(nèi)的毒性作用，來確定化學物質(zhì)最大容許濃度及其影響程度。通過慢性毒性實驗可觀察同種魚在不同發(fā)育階段（發(fā)育代）對化學物質(zhì)的毒性差異。蓄積實驗則檢測外來化學物質(zhì)在機體內(nèi)蓄積或富集性大小的實驗。5.2分子及細胞生態(tài)毒理中的應(yīng)用化學物質(zhì)進入生物體后，對生物產(chǎn)生不同程度的危害。生物在受到損傷或致死前，其行為、生理、生化已發(fā)生反應(yīng)，可以選擇這些在分子和細胞水平上的指標測定化學物質(zhì)對生物的影響。例如，在斑馬魚胚胎發(fā)育晚期，硫代硫酸鈉可刺激胚胎細胞的大量異常增殖，這些異常細胞會引起胚胎的部分器官發(fā)育畸形?？赏ㄟ^胚胎、軟骨組織染色，或全組織包埋原位雜交等技術(shù)進行顯微觀察。5.3水質(zhì)檢測中的應(yīng)用運用轉(zhuǎn)基因斑馬魚的某些效用元件來顯示其接觸的特定污染物可檢測水質(zhì)的變化。例如，斑馬魚可檢測水環(huán)境中雌激素污染，當水樣中存在一定濃度的雌激素時，會發(fā)現(xiàn)斑馬魚發(fā)育過程中出現(xiàn)性別的干擾和反轉(zhuǎn)現(xiàn)象。而轉(zhuǎn)基因斑