內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 （凝膠法）,蘇州大學(xué) 衛(wèi)生與環(huán)境技術(shù)研究所,內(nèi) 容,基本概念 實(shí)驗(yàn)方法 操作注意事項(xiàng),細(xì)菌內(nèi)毒素,細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物,它主要化學(xué)成分是脂多糖。細(xì)菌在生活狀態(tài)下不會釋放出來，只有當(dāng)細(xì)菌死亡后才會表現(xiàn)出毒性。,一、概念及相關(guān)知識,熱原反應(yīng)：病人在靜脈給藥15分鐘后發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。 熱原：任何可以導(dǎo)致肌體發(fā)熱的物質(zhì)。 機(jī)理：外源性熱原質(zhì)通過內(nèi)源性熱原質(zhì)起作用。,外源性 熱原質(zhì),吞噬性 白細(xì)胞,內(nèi)源性 熱原質(zhì),體溫調(diào)節(jié) 中心,發(fā) 熱,新蛋白合成,新mRNA翻譯,1942年，美國藥典首次收載熱原檢查法，中國藥典自第一版（195

2、3年版）起收載。 所有注射用藥品（肌肉注射、靜脈注射）都要經(jīng)過熱原檢查。 熱原檢查法的局限性： 1、重現(xiàn)性差。 2、對藥物引起的增加、抑制作用無法控制。 3、不同細(xì)菌產(chǎn)生的熱原質(zhì)的致熱域有差別。 4、非定量反應(yīng)。 雖然不排除有其他熱原物質(zhì)存在，但細(xì)菌內(nèi)毒素是最主要的熱原物質(zhì)。,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)： 肽聚糖 脂蛋白 革蘭氏陽性菌 革蘭氏陰性菌 外膜 磷壁酸 脂多糖 細(xì)菌內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。當(dāng)細(xì)胞壁外膜結(jié)構(gòu)完整時不具備生物活性，只有當(dāng)細(xì)菌死亡，脂多糖脫落才顯示出內(nèi)毒素活性。 脂多糖結(jié)構(gòu)：多糖O抗原核心多糖類脂A,致熱活性部分,細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性,1、致熱性。 2、致死性

3、毒性。 3、白細(xì)胞減少。 4、激活凝血系統(tǒng)。 5、降低血壓，休克。 6、 Shwartzman反應(yīng)。 7、刺激淋巴細(xì)胞有絲分裂，等等 。,細(xì)菌內(nèi)毒素的耐熱性,細(xì)菌內(nèi)毒素具很強(qiáng)的耐熱性，一般的高壓滅菌不能去除細(xì)菌內(nèi)毒素，需250至少30分鐘以上的干熱滅菌才能使其滅活 。,實(shí)驗(yàn)用器具的處理,內(nèi)毒素試驗(yàn)中使用的器皿都要經(jīng)過處理去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。 耐高溫的玻璃器皿等置于電熱干烤箱內(nèi)180干烤至少2h或者250干烤至少30分鐘； 塑料器皿置于30雙氧水中浸泡4h，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水充分沖洗，60烘干備用。,細(xì)菌內(nèi)毒素的單位,內(nèi)毒素的量值： 1、內(nèi)毒素單位（EU） 1982年FDA將當(dāng)時美國

4、代號為EC2的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)定為5EU/ng。1983年內(nèi)毒素單位（EU）被USP正式引用。 2、國際單位（IU） WHO先后兩次組織協(xié)作標(biāo)定，建立內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品，其中第二批內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品適用于所有內(nèi)毒素檢查法，且明確1IU1EU。,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,凝膠法 濁度法 光度法 顯色基質(zhì)法 重現(xiàn)性好 能定量 能控制藥物的增強(qiáng)/抑制干擾 操作簡便。節(jié)省時間,方法 分類,方法 特點(diǎn),細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法概念,本方法是利用鱟試劑檢測由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法 。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，由于凝膠法操作簡單快捷、靈敏度高，并且藥典規(guī)定

5、當(dāng)不同試驗(yàn)方法的結(jié)果存在爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準(zhǔn)，所以凝膠法被廣泛應(yīng)用。,鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動物門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。 鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。,凝膠法概念,凝膠法是通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。,鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)機(jī)理,內(nèi)毒素,C因子,活化的C因子,凝膠,B因子,凝固酶原,凝固酶,活化的B因子,凝固蛋白原,鱟凝血系統(tǒng)酶聯(lián)反應(yīng),二

6、、細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法,實(shí)驗(yàn)程序 1、試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具 2、選擇鱟試劑靈敏度，計(jì)算樣品稀釋度 3、鱟試劑靈敏度復(fù)核 4、供試品干擾試驗(yàn)（新藥或新方法） 5、供試品內(nèi)毒素限量檢查,凝膠法中用到的儀器,1. 超凈工作臺,凝膠法中用到的儀器,2. 恒溫培養(yǎng)箱 孵育樣品浸提液以及培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果。,凝膠法中用到的儀器,3.干烤箱 用于實(shí)驗(yàn)用耐高溫器皿的去熱源，溫度范圍要求至少300,凝膠法中用到的儀器,4. 移液器和無熱源的移液尖（或者去熱源的刻度吸管） 5. 計(jì)時器、漩渦混合器、電子天平等,凝膠法中用到的器皿,凝膠法中用到的試劑,1）鱟試劑：具有國家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號 2）細(xì)菌內(nèi)毒素工作品 3）細(xì)菌內(nèi)

7、毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的無菌水） 4）75乙醇,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（）,將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘, 然后制成2、1、0.5和0.25四個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),取復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管各加入0.1m

8、l細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。 將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入371的適宜恒溫器中，保溫60分鐘2分鐘。,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),結(jié)果觀察 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180時，若管內(nèi)形成凝膠，且不從管壁滑脫者為陽性；若不形成凝膠，或形成凝膠但倒轉(zhuǎn)180后從管壁滑脫者為陰性。 保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),若最大濃度2.0管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（c），計(jì)算方法見中國藥典。 反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的

9、濃度。 當(dāng)c在0.52.0（包括0.5和2.0）時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。,凝膠法的試驗(yàn)步驟,下面我們結(jié)合中國藥典2010、 GB 14233.2醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 以及GB 15810一次性無菌注射器 來學(xué)習(xí)具體試驗(yàn)方法。,實(shí)驗(yàn)步驟,浸提介質(zhì)（細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水）體積計(jì)算公示： V浸提介質(zhì)體積，單位為（ml）； L產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（該產(chǎn)品允許含有的細(xì)菌內(nèi)毒素的量），單位為EU/件； 鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值，單位為EU/ml。,實(shí)驗(yàn)步驟,樣品處理方法： a）管類和容器類器具用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水浸泡器具內(nèi)腔，在（371）恒溫箱中孵育不少于1h，

10、取浸提液進(jìn)行試驗(yàn)； b）小型配件或?qū)嶓w類樣品置無熱源玻璃器皿內(nèi)，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水振蕩數(shù)次，在（371）恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進(jìn)行試驗(yàn)。 制備的供試液儲存不應(yīng)該超過2h。一般要求供試液的PH值在6.08.0之間，如不在該范圍內(nèi)，可用鱟試劑廠家提供的PH緩沖液調(diào)節(jié)浸提液的PH值。,實(shí)驗(yàn)步驟,結(jié)果觀察,B、C溶液的反應(yīng)管必須要陽性，就是輕輕倒轉(zhuǎn)180度過來，鱟試劑安瓿里的反應(yīng)溶液形成了凝膠體，不滑落。 而D溶液，就是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水那2管，必須要陰性，3個條件都滿足，就說明試驗(yàn)結(jié)果是可信的。最后看A溶液的反應(yīng)情況： 陽性就說明原套器具每件大于20EU，判定為不合格； 陰性就說明小于

11、20EU,結(jié)果是合格的； 1管陽性、1管陰性則要重新復(fù)查，復(fù)試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性則判斷合格；否則判斷為不合格。,注意事項(xiàng),1. 每批鱟試劑在用于試驗(yàn)前首先要進(jìn)行靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)； 2. 安瓿開啟前應(yīng)先用砂石劃痕(不管是色點(diǎn)或包環(huán)易折安瓿)，用手半拉半掰將頸部折斷，千萬不能用鑷子敲擊，防止碎玻屑掉入安瓿。 3. 在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加入時，取樣均應(yīng)準(zhǔn)確，緩緩加入避免氣泡。 4. 保溫過程中不可隨時取出觀察，防止形成的凝膠受到振動后變形而誤判為陰性。,注意事項(xiàng),5. 凍干的鱟試劑應(yīng)存放在2-8下；避免長時間放置在高于25的溫度條件下。已復(fù)溶的鱟試劑在間歇使用過程

12、中最好放在2-8的冰箱里，可存放24小時，在-20以下，可存放四個星期，鱟試劑只能凍融一次。,三、操作注意事項(xiàng),試驗(yàn)前準(zhǔn)備： 1、玻璃器具應(yīng)規(guī)范化，便于除熱原、計(jì)量準(zhǔn)確、清洗操作方便。 洗凈 去污去內(nèi)毒素 去洗滌劑 精洗 除外源性熱原：250 干烤至少1小時。 2、盡量用鋁制器具和不銹鋼用具，且用蒸餾水沖洗后250 干烤至少1小時。 3、用于內(nèi)毒素檢測的稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且保證無內(nèi)毒素。,實(shí)驗(yàn)環(huán)境：最好在潔凈室或潔凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，保證環(huán)境溫度、濕度及通風(fēng)穩(wěn)定。 實(shí)驗(yàn)人員：用適宜的洗滌劑洗手，用75酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。 實(shí)驗(yàn)過程： 1、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)嚴(yán)格按要求低溫保存；工作標(biāo)準(zhǔn)品開封后盡快使用且應(yīng)一次性用完，不再保存。 2、溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品用封口膜封口后在漩渦振蕩器上混勻15min；進(jìn)一步稀釋時每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s。,振蕩前,振蕩后,內(nèi)毒素分子在水溶液中的狀態(tài),3、每一步稀釋液所用的移液器不能反復(fù)、交叉使用。 4、鱟試劑復(fù)溶時應(yīng)將檢查用水順著瓶壁加入，避免產(chǎn)生氣泡。 5、操作時間的長短。環(huán)境溫度